纳米蜂胶黄酮体内外抗PPV活性试验

马　霞，王长林，郭振环，刘永录，沈志强（.河南牧业经济学院，河南郑州4500；.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州56600）



纳米蜂胶黄酮体内外抗PPV活性试验

马霞1，2，王长林1，郭振环2，刘永录1，沈志强2
（1.河南牧业经济学院，河南郑州450011；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600）

摘要：采用体内外试验研究纳米蜂胶黄酮抗猪细小病毒活性。体外试验，以普通蜂胶黄酮为对照，分3种加药方式（先加蜂胶，后加蜂胶，蜂胶和病毒同时加入）加至PK-15细胞中，用MTT法检测细胞活性，实时荧光PCR检测PK-15细胞中猪细小病毒（PPV）含量，观察蜂胶黄酮对PK-15细胞抗PPV及清除PPV能力的影响。结果显示，与普通蜂胶黄酮相比，纳米蜂胶黄酮可显著抑制PPV在PK-15细胞上生长，高浓度效果优于低浓度，3种加药方式中先加药物的效果最好。体内试验，豚鼠注射PPV后灌胃纳米蜂胶黄酮和普通蜂胶黄酮，检测血液中PPV含量、血清中HI含量。结果显示，高、中剂量的纳米蜂胶黄酮可以显著抑制PPV在血液中复制、减轻PPV对豚鼠体重的影响、提高血清HI效价。结论，普通蜂胶黄酮经纳米化处理后，可以显著提高其抗PPV活性。

关键词：纳米蜂胶黄酮；猪细小病毒；体内；体外；抗病毒活性

蜂胶是一种蜜蜂从植物树干及花苞上采集并混入其上颚腺分泌物和蜂蜡等物质而成的具有芳香气味的胶状固体物质。其有效成分主要是黄酮类化合物。蜂胶黄酮具有抗病毒、抗菌、抵氧化、免疫调节、抗肿瘤等作用[1-2]，蜂胶及其黄酮等有效成分经过纳米化处理可以进一步提高其抗病毒、免疫增强、抗氧化等生物活性[3-4]。

本试验在前期研究发现，蜂胶乙醇提取物（黄酮成分为主）体外具有抗猪细小病毒（PPV）作用的基础上[5]，对蜂胶黄酮进行纳米化处理，通过体内外试验比较其纳米化前后抗猪细小病毒活性。

1　材料与方法

1.1毒株、细胞和实验动物PPV-SD1毒株，山东省滨州畜牧兽医研究院分离、鉴定后保存；猪肾原传代细胞（Porcine kidney 15，PK-15），中国兽医药品监察所提供；健康豚鼠，体重350 g左右，购自北京中医药大学动物中心。

1.2主要试剂和仪器纳米蜂胶黄酮（NPF）和普通蜂胶黄酮（PF），由山东省滨州畜牧兽医研究院蜂胶疫苗工程技术研究中心制备并提供；胰蛋白酶，DMEM培养基，均购自Gibco公司；新生牛血清，杭州四季青生物有限公司产品。荧光定量PCR仪（7300型），美国ABI公司；CO2培养箱（371型），Thermo公司生产；细胞培养瓶和96孔细胞培养板，德国Nunclon公司生产；倒置显微镜，重庆光学仪器厂生产。

1.3体外试验将NPF和PF分别从安全浓度（500 μg/mL-1）开始倍比稀释5个浓度。按先加蜂胶后加病毒（pre-adding pattern），先加病毒后加蜂胶（post-adding pattern），蜂胶和病毒感作2 h后同时加入（simultaneous adding pattern）3种方式加到长成单层PK-15细胞中，每浓度重复4孔，同时设病毒对照和细胞对照孔。培养72 h后MTT法测定细胞活性。实时荧光定量PCR检测PK-15细胞体系中PPV含量[2]。

1.4体内试验160只豚鼠随机均分为8组，1～7组肌肉注射104.5TCID50剂量的PPV攻毒，攻毒后1～3组和4～6组分别灌胃2、4、8 g/kg·d低中高剂量的NPF和PF，第7组攻毒对照组，第8组为空白对照组。攻毒后第3（D3）、7（D7）、14（D14）、21（D21）天，心脏采血，荧光定量PCR测定全血中PPV含量，β-微量法测定血清特异性HI-抗体，称重观察体重变化。

1.5数据分析数据以X±SE表示，用SPSS 11.5软件统计分析组间的差异性。

2　结果

2.1体外试验

2.1.1体外抗病毒感染细胞活性在先加药物方式中，NPF组在15.6～250 μg/mL范围内A570值显著高于PF组和病毒对照组（P<0.05）；在后加药物和药物病毒作用后同时加入方式中，NPF组在31.2～250 μg/mL范围内A570值均显著高于PF组和病毒对照组，PF组在125～250 μg/mL范围内A570值均显著高于病毒对照组（P<0.05）（表1）。

表1　3种加药方式各组细胞的A570值

表2　3种加药方式各组PPV含量（×106/mL）

2.1.2体外抗病毒感染PK-15细胞中PPV含量在3种加药方式中，NPF和PF组在31.2～250 μg/mL范围内PPV含量显著低于病毒对照组（p<0.05）；在先加药物方式中，NPF组在31.2～250 μg/mL范围内PPV含量显著低于PF组（P<0.05）（表2）。

2.2体内试验

2.2.1攻毒后血液中PPV含量攻毒后D7、D14和D21，NPF和PF高中低剂量组血液中的PPV含量显著低于病毒对照组，NPF高中低剂量组显著低于PF组（P<0.05）（图1）。

2.2.2攻毒后血清中HI含量在HI抗体效价指标变化中，攻毒后D7，NPF高中剂量组的HI抗体效价显著高于PF组和病毒对照组，PF高剂量组显著高于病毒对照组（P<0.05）；攻毒后D14和D21，NPF和PF高中剂量组的HI抗体效价显著高于病毒对照组，NPF高中剂量组显著高于PF组（P< 0.05）（图2）。

图1　血液中PPV含量（×103/copies·μL）注：标注不同字母者表示NPF或PF中各组差异显著（P<0.05），*：NPF与PF中相应组间差异显著（P<0.05），下表同

图2　攻毒后血清HI抗体含量变化

2.2.3攻毒后体重变化攻毒后D7，NPF和PF高剂量组的体重显著低高于病毒对照组（P<0.05）；攻毒后D14和D21，NPF组高中剂量组与PF高剂量组显著高于病毒对照组，NPF高中剂量组显著高于PF组（P<0.05）（表3）。

表3　攻毒后各组体重变化

3　讨论

体外试验结果表明，NPF和PF均可提高PK-15在接种PPV后的细胞活性，减少PK-15细胞体系中的PPV含量，均具有降低PPV感染PK-15细胞的能力。浓度越高该作用效果越明显，且以先加药物的方式最好，NPF效果优于PF。我们前期亦发现，蜂胶通过提高PK-15细胞活性和减少细胞体系中PPV含量而具有很好的抗PPV作用，且与浓度呈正相关[5]。

体内试验采用豚鼠观察和比较了NPF和PF体内抗PPV活性，结果表明，与病毒对照组相比，NPF 和PF体内均可以显著降低血液中PPV含量、提升血清HI抗体、减轻PPV对豚鼠体重的影响，并且NPF的综合效果多优于PF。推测NPF和PF通过提高特异性抗体发挥抗病毒作用，孔祥峰等在研究蜂胶黄酮抗新城疫病毒作用时亦有相似报道[6]。

本试验发现，NPF的体内抗PPV效果多显著优于PF。很多文献亦报道经纳米化处理后可以提高药物生物活性。Fan等研究发现，蜂胶经脂质体处理后达到纳米级可提高其免疫增强活性和抗氧化效果[3]。李雅晶等报道，与普通蜂胶比较，蜂胶经纳米化后可以显著提高其对试验性高血脂大鼠脂质代谢的调节作用，提高脂质代谢的酶活性和降低甘油三酯和胆固醇浓度[7]。

参考文献：

[1]顾青，张燕平，钟立人.蜂胶中有效成分提取工艺研究[J].浙江农业学报，2001，13（3）：161-163.

[2] Xia Ma，Zhenhuan Guo，Zhiqiang Shen，et al . The immune en⁃hancement of propolis adjuvant on inactivated porcine parvovirus vaccine in guinea pig [J].Cellular Immunology，2011，270，13-18.

[3] Yunpeng Fan，Lin Ma，Weimin Zhang，et al . Microemulsion can improve the immune-enhancing activity of propolis flavonoid on immunosuppression and immune response[J].International Journal Biollogical Macromolecules，2014，63：126-132.

[4] Yunpeng Fan，Lin Ma，Weimin Zhang，et al.The design of propo⁃lis flavone microemulsion and its effect onenhancing the immuni⁃ty and antioxidant activity in mice[J].International Journal Biollog⁃ical Macromolecules，2014，63：200-207.

[5]马霞，刘永录，张志辉，等.蜂胶体外对猪细小病毒感染细胞能力的影响[J].中国畜牧兽医，2013，40（12）：196-199.

[6]孔祥峰，胡元亮，王德云，等.中药成分与新城疫病毒感作后对病毒感染活性的影响[J] .南京农业大学学报，2004，27 （2）：90-93.

[7]李雅晶，冯磊，胡福良，等.纳米蜂胶对实验性高脂血症大鼠脂质代谢的影响[J].中国药学杂志，2007，42（12）：903-906.

中图分类号：S852.65+1

文献标志码：B

文章编号：0529-6005（2016）05-0096-03

收稿日期：2015-01-16

基金项目：山东省自然科学基金项目（2011ZRA16002）

作者简介：马霞（1978-），女，讲师，博士，主要从事中兽药药理学研究，E-mail：maxia801010 @126.com

通讯作者：沈志强，E-mail：bzshenshi@126.com