转化黄体酮菌株的筛选及转化产物研究*

罗莎莎，李卫天，蒋　丹，苏志伟，黄守瑞，冷　潇△

1.成都医学院 科研实验中心(成都　610083)；2.宜宾学院 生命科学与食品工程学院(宜宾　644000)

转化黄体酮菌株的筛选及转化产物研究*

罗莎莎1，李卫天2，蒋丹1，苏志伟1，黄守瑞1，冷潇1△

1.成都医学院 科研实验中心(成都610083)；2.宜宾学院 生命科学与食品工程学院(宜宾644000)

【摘要】目的用微生物转化的方法获得新型的黄体酮类衍生物，对于相关新药的研发至关重要。方法通过微生物转化，利用薄层层析法(TLC)和硫酸显色法跟踪监测，筛选能够有效转化黄体酮的菌株，然后通过硅胶柱层析法对发酵液中的转化产物进行分离纯化，将纯化产物进行质谱、红外光谱和核磁共振谱表征，确定转化产物的物质结构。结果本研究筛选到了1株真菌，通过分子生物学鉴定其为Fusarium属，该菌能够完全转化底物黄体酮，同时得到2种重要的药物中间体：雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和睾内酯。结论本研究筛选得到的这株菌对大规模发酵生产雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和睾内酯具有潜在的应用价值。

【关键词】黄体酮；睾内酯；雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮；薄层层析法

黄体酮(progesterone)，全称4- 孕甾烯 -3,20- 二酮，又称孕酮、孕烯二酮、助孕素等，是一种临床常用孕激素类药物。用生物转化方法获得黄体酮类衍生物是生产甾体药物中间体的重要方法[1]。1952年，Murray和Peterson用黑根霉对黄体酮进行转化，得到了11α-羟基黄体酮，大大缩短了合成皮质酮的步骤，解决了生产可的松等皮质类药物的原料来源这一最大难题[2]。目前，对黄体酮类衍生物的研究主要集中在C-11位和C-16位羟基化方向，而该化合物其他反应类型在国内外很少报道[3]，为此，本研究利用微生物对黄体酮进行生物转化，以期获得具有重要活性的新型衍生物。

1材料与方法

1.1菌株

本研究所用菌株为从成都动物园土壤中分离并保存的真菌菌株。

1.2培养基

PDA培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉15 g、水1 000 mL、自然pH；转化培养基：葡萄糖25 g、黄豆粉10 g、酵母膏10 g、氯化钠5 g、磷酸氢二钾5 g、水1 000 mL、pH5.5。

1.3黄体酮转化菌株筛选

挑选本实验室保存的50株有甾体转化能力的真菌，于PDA培养基28～30 ℃活化5 d，制备孢子悬液。用10 mL无水乙醇溶解0.5 g 黄体酮，制成底物溶液。孢子悬液按5%的量接种发酵液，28 ℃，200 r/min，空气摇床震荡培养1 d， 加入0.5 g/L黄体酮底物溶液，28 ℃，200 r/min，震荡培养转化2 d。 投放底物溶液后，每隔12 h取1 mL发酵液，加入等体积三氯甲烷进行萃取，薄层层析法(TLC)分析转化产物，展开剂为(乙酸乙酯∶三氯甲烷=8∶1，v/v)，然后喷洒显色剂(硫酸∶甲醇=1∶10,v/v)，105 ℃干燥箱中，加热3 min后，进行观察。

1.4菌株分子生物学鉴定

采用CTAB法，提取菌株的总DNA为模板，进行PCR扩增[4]，扩增采用的是1对真菌通用引物[5]，其中，上游引物的序列为：5′-TCCGTAGGT GAACCTGCGG-3′，下游引物的序列为：5′-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3′。 PCR反应体系为50 μL： 基因组DNA 4 μL，上下游引物各1 μL， 2.5 mM dNTP mix 5μL，10×PCR 缓冲液5 μL， Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 33.5 μL。PCR扩增程序：1)94 ℃预变性5 min；2)94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；3)72 ℃延伸7 min。用DL2000 DNA Marker作分子量标记， 1.5%琼脂糖电泳90 v进行40 min，同时，将扩增产物委托华大基因测序。

1.5黄体酮转化产物的分离纯化

投放底物溶液转化2 d后，取出发酵液，等体积三氯甲烷萃取3次，合并萃取液，用旋转蒸发仪旋干，得到晶体。用硅胶柱层析法纯化转化产物，湿法上柱，将晶体用少量洗脱液溶解后上样，控制流速为1 mL/min，部分收集器收集洗脱液，TLC法分析洗脱液，把Rf值相同的物质合并，用旋转蒸发仪旋干，溶解后再进行点样，进行硫酸显色检测，确保产物纯度。

1.6生物转化产物的结构鉴定

将纯化产物进行质谱(TOF-MS)、红外光谱(IR)和核磁共振谱(NMR)表征，同时，结合文献[6]和实验室之前纯化得到的黄体酮类衍生物光谱数据进行分析，确定转化产物物质结构。

2结果

2.1黄体酮转化菌株的筛选

实验室保存的50株真菌均为霉菌，初筛发现都能够在以甾体类物质为唯一碳源的培养基上生长，所以，可能存在能有效转化黄体酮的菌株。通过以黄体酮为底物进行生物转化，TLC法和硫酸显色法检测转化情况，筛选到有8株菌对黄体酮有转化能力。

检测结果表明，菌株1-2转化能力最强，转化2 d后， 黄体酮完全降解，生成2种转化产物，产量较高，便于后期纯化，同时，其中1个产物的Rf值不同于实验室之前获得的转化产物，可能是结构比较新颖的衍生物。因此，本研究选择1-2这株菌进行研究(图1)。

图1TLC法分析菌株1-2转化黄体酮

注：1、黄体酮标品；2、菌株1-2转化黄体酮情况

2.2菌株分子生物学鉴定

根据1.4的方法，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增序列，同时，委托华大基因进行测序，发现该序列大小为542 bp，与预期大小相符(图2)。其核苷酸序列如下：

TTCCTCTCGCCTTATTGATATGCTTAAGTT CAGCGGGTATTCCTACCTGATTCGAGGTCA ACTTCAGAAGAGTTGGGGGTTTTACGGCGT GGCCGCGCCGCTCTCCAGTCGCGAGGTGTTA GCTACTACGCGATGGAAGCTGCGGCGGGAC CGCCACTGTATTTGGGGGACGGCGTGTGCCC ACGGAGGGCCTCCGCCGATCCCCAACGCCAG GCCCGGGGGCCTGAGGGTTGTAATGACGCT CGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCG GGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGAT TCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTAT CGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAG AGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAA TTTATTTGCTTGTTTTACTCAGAAGAAACA TTATAGAAACAGAGTTAGGGGGTCCTCTGG CGGGGGCGGCCCGTTTTCACGGGGCCGTCTG TTCCCGCCGAGGCAACGTTTAGGTATGTCA CAGGGTGATGAGTGTTAGTCCGTCCCA

通过将该序列在Genbank数据库中进行BLAST同源序列比对，发现该菌与Nectriahaematococca(Fusariumsolani的有性型)同源性为100%，因此，初步确定该菌为Fusarium属，故命名为Fusariumsp.1-2。

2.3转化产物分离及鉴定

通过TLC法和硫酸显色法进行定时跟踪检测，初步了解到该菌以黄体酮做底物的生物转化过程(图3)。转化1 d时，产物 P-1出现，2 d时，P-1达到最大量，转化率为72%， 同时产物P-2出现，转化率为28%，此时黄体酮彻底降解。

图2菌株1-2 PCR产物电泳检测结果

注：1、菌株1-2 PCR产物；2、DL2000 DNA Marker

图3黄体酮生物转化过程

将纯化产物进行TOF-MS、IR和NMR表征，得到表征数据如下：

P-1，雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(androst-1,4-dien-3,17-dione) mp 139～141 ℃;IR vmax (cm-1) 1 740, 1 656, 1 621, 1 601; TOF-MS m/z 285 [M+H]+,307 [M+Na]+,323 [M+K]+,591 [2M+Na]+;1H NMR (CDCl3) δ (ppm) 7.04 (1H,d,J = 10 Hz,H-1),6.24 (1H,dd,J = 10.2,1.9 Hz,H-2),6.09 (1H,s,H-4),0.95 (3H,s,H-18), 1.25 (3H,s,H-19)。

P-2，17同质-氧杂-雄甾-1，4二烯-3，17二酮(17-oxa-homo-androst-1,4-diene-3,17-dione)；TOF-MS m/z 301.176 1 [M+H]+,323.162 3 [M+Na]+,339.136 4 [M+K]+;1H NMR (CDCl3) δ(ppm) 7.04 (1H,d,H-1),6.25 (1H,dd,H-2),6.09 (1H,s,H-4),1.22 (3H,s,H-19),1.39 (3H,s,H-18)。

代谢产物P-1的质谱表明其分子量为284，结合碳谱(表1)确定其化学结构式为C19H24O2，且其1HNMR、13CNMR和IR数据与相关文献[6]报道完全一致。因此，确定产物P-1为雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮。

代谢产物P-2的质谱表明其分子量为300，结合碳谱(表1)，确定其化学结构式为C19H24O3，且其1HNMR、13CNMR和IR数据与相关文献[6]报道完全一致，因此，确定化合物P-2为睾内酯。

表1　黄体酮及转化产物NMR谱值

3讨论

黄体酮生物转化的研究过去主要集中在C-11位和C-16位等羟基化方向[7]，Fusarium菌属转化黄体酮生成睾内酯的相关报道很少。TLC法和硫酸显色法跟踪检测结果表明，用菌株Fusariumsp.1-2转化黄体酮，转化1 d，雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮生成，转化2 d，黄体酮完全降解，同时发酵液中生成睾内酯，根据转化产物的生成顺序，推测通过Fusariumsp.1-2的生物转化酶系，黄体酮侧链被降解，生成雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮，并在C-17位生成酮基，雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮再在C-17位的酮基旁引入氧，形成内酯，该反应为典型的Baeyer-Villiger反应[8]。目前，霉菌中仅见到青霉属菌对去氢表雄酮、孕烯醇酮和雄烯二酮进行类似的反应[9]。

用Fusariumsp.1-2转化黄体酮，雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和睾内酯2种转化产物的转化率分别约为72%和28%，产物产量较高，没有检测到副产物，便于后期纯化。雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和睾内酯是重要的甾体药物中间体，利用雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮能合成一些非常重要的激素类药物，如口服避孕药、蛋白同化激素和一些性激素[10]；睾内酯作为芳香酶抑制剂，对于治疗女性乳腺癌具有一定疗效。因此，该菌对于甾体激素类药物的生产具有较强的应用潜力，有关利用该菌发酵生产雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和睾内酯的发酵条件的优化还在进一步研究中。

参考文献

[1]Hampl R,Kubátová J,Stárka L.Steroids and endocrine disruptors-History,recent state of art and open questions[J].J Steroid Biochem Mol Biol,2016,155(Pt B):217-223.

[2]Adamski J.Perspectives in steroid research[J].The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology,2015,153:1-2.

[3]Ge Z,Mao S,Li Y,etal.16β-hydroxylation of 4-androstene-3,17-dione by Aspergillus niger[J].Chinese Journal of Biotechnology,2014,30(9):1481-1485.

[4]Khan Z,Ahmad S,Joseph L,etal.Isolation of cholesterol-dependent,multidrug-resistant Candida glabrata strains from blood cultures of a candidemia patient in Kuwait[J].BMC Infect Dis,2014,14:188.

[5]Suo FY,Huang LD,Yu H.Identification and antibacterial effect research of a Tolypocladium strain isolated from sclerotium of Ophiocordyceps gracilis in Xinjiang[J].Zhongguo Zhong Yao Za Zhi,2014,39(6):965-971.

[6]Chapuy-Regaud S,Subra C,Requena M,etal.Progesterone and a phospholipase inhibitor increase the endosomal bis(monoacylglycero)phosphate content and block HIV viral particle intercellular transmission[J].Biochimie,2013,95(9):1677-1688.

[7]Hosseinabadi T,Vahidi H,Nickavar B,etal.Biotransform-ation of Progesterone by Whole Cells of Filamentous Fungi Aspergillus brasiliensis[J].Iran J Pharm Res,2015,14(3):919-924.

[9]Hunter AC,Patel S,Dedi C,etal.Metabolic fate of 3α,5-cycloandrostanes in the endogenous lactonization pathway of Aspergillus tamarii KITA[J].Phytochemistry,2015,119:19-25.

[10] Ghasemi S,Mohajeri M,Habibi Z.Biotransformation of testosterone and testosterone heptanoate by four filamentous fungi[J].Steroids,2014,92:7-12.

Screening of Progesterone-transforming Strains and the Reaserch on Its Transformation Products

LuoShasha1,LiWeitian2,JiangDan1,SuZhiwei1,HuangShourui1,LengXiao1△.

1.CenterforScientificReseach,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China; 2.CollegeofLifeScienceandFoodEngineering,YibinCollege,Yibin644000,China

【Abstract】ObjectiveThe new progesterone derivatives obtained with the microbial transformation method are vital for the research and development of new drugs. MethodsTLC and Sulfuric acid methods were adopted to screen the strains which are capable of transforming progesterone with the help of microbial transformation. The silica gel column chromatography was used to purify the products in the fermented liquid, and mass spectrum, infrared spectrum and nuclear magnetic resonance spectrum were employed to identify the structure of the purified products. ResultsA strain which could transform progesterone completely was screened and identified as Fusarium of Molecular biology identification. Two important intermediates of hormone drugs in the purified transformation products were aquired and identified as Androst-1,4-dien-3,17-dione and testolactone. ConclusionThe screened strain is of potential value in producing the two important intermediates of hormone drugs including Androst-1,4-dien-3,17-dione and testolactone in a lager scale.

【Key words】Progesterone; Testolactone; Androst-1,4-dien-3,17-dione; Thin layer chromatography

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.02.006

基金项目：＊国家大学生创新项目(No:201513705041 )

通信作者：△冷潇，E-mail:417470951@qq.com

【中图分类号】Q939.9

【文献标志码】A

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160406.1555.028.html

·论著·