响应面法优化酶法提取油茶籽饼粕多糖工艺

金日生， 徐冰彦，袁传勋*

(1.合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽合肥 230009;2.中国林业科学研究院林产化学工业研究所，江苏南京 210042)

响应面法优化酶法提取油茶籽饼粕多糖工艺

金日生1,2， 徐冰彦1，袁传勋1*

(1.合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽合肥 230009;2.中国林业科学研究院林产化学工业研究所，江苏南京 210042)

摘要[目的]提高油茶籽饼粕多糖的提取率。[方法]以榨油后的油茶籽饼粕为原料，利用酶水解与传统热水浸提相结合的方法提取油茶籽饼粕多糖。考察了中性蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶及果胶酶对油茶籽饼粕多糖提取率的影响，对提取工艺中酶解温度、酶解时间、酶添加量分别进行单因素试验，在此基础上利用3因素3水平的响应面法优化工艺参数。[结果]中性蛋白酶法提取油茶籽饼粕多糖的酶解最佳工艺条件为酶解温度40 ℃、酶解时间120 min、加酶量2.0%，此工艺条件下粗多糖得率为15.66%，是优化前得率7.65%的2.05倍。[结论]该方法提取率高，是一种有效的油茶籽饼粕多糖提取方法。

关键词油茶籽饼粕；多糖；酶法；单因素试验；响应面分析

油茶是山茶科山茶属多年生乔木，是我国特有的木本油料作物[1]。油茶籽饼粕是油茶籽榨油后的残余物，年平均产量约为39.71万t[2]。油茶籽饼粕中除含有油脂外，还有蛋白质、糖类等营养物质[3]。研究表明，油茶籽饼粕主要含有多糖15%～30%，茶皂素10%～15%，粗蛋白10%～15%[4]。据报道，油茶籽多糖具有抗血栓[5]、降血糖血脂、抗动脉粥样硬化、降血压、防治心血管疾病等作用[6]；此外，其对增加血清凝集素抗体、增强机体免疫力以及修复代谢紊乱也有明显效果[7]。而目前油茶籽粕大部分被用作清塘剂、肥料和燃料，甚至被废弃，少量用于茶皂素的提取，极少部分用作饲料，造成了很大的浪费。因此，加大对油茶籽副产物尤其是油茶籽粕资源的综合利用，开发油茶籽粕多糖，对提高油茶资源综合利用率、延长产业链均具有重要意义。

目前，油茶籽饼粕多糖提取方法有热水浸提法、醇提法、发酵法、微波辅助提取、超声波辅助提取等[7-10]。由于酶法作用条件温和、操作相对简单且具有较高的提取率，也常用于多糖的提取[11]。王维香等采用复合酶解法提取裙带菜硫酸多糖，与单纯热水浸提相比，该法可提高硫酸多糖提取率，多糖得率达7.76%[12]。王元凤等比较了热水提取、果胶酶提取、复合酶提取3种方法对茶多糖提取效果的影响，结果表明，热水提取后的茶渣采用复合酶在最佳条件下(pH 5.5、加酶量0.5%、温度40 ℃、时间3 h)提取，茶多糖的提取率为3.29%，是水提的2.70倍[13]。目前少见酶法辅助提取油茶籽饼粕多糖的报道，因此，笔者进行了酶法提取油茶籽饼粕多糖的研究工作。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料及主要试剂。油茶籽饼粕，安徽大别山科技开发有限公司。中性蛋白酶(活性:100 U/mg)、果胶酶(活性:100 U/mg)、纤维素酶(活性:30 U/mg)、半纤维素酶(活性:30 U/mg)，合肥博美生物科技有限公司。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、98%浓硫酸、苯酚、无水乙醇等，均购自于国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.1.2主要仪器设备。752N紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；数显恒温水浴锅，上海申胜生物技术有限公司； LG10-2.4A离心机，北京医用离心机厂；RE52CS-1旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；FD-1冷冻干燥机，北京博医康技术公司。

1.2方法

1.2.1油茶籽饼粕多糖的提取工艺流程。油茶籽饼粕原料→酶解→提取→抽滤→醇沉→抽滤→干燥→粗多糖制品。精确称取油茶籽饼粕原料1.0 g，加入10倍量磷酸盐缓冲液(pH 7.5)、一定量的酶，在一定温度下，酶解一定时间。移入95 ℃水浴锅，灭酶。然后再加入10倍量去离子水，调整料液比至1∶20 g/mL， 90 ℃水浴提取30 min，离心，收集上层清液，加入5倍体积无水乙醇，搅拌，多糖沉淀析出，静置过夜，收集沉淀，真空冷冻干燥得油茶籽饼粕粗多糖。

1.2.2油茶籽饼粕多糖得率的测定。具体公式如下：

式中，粗多糖质量即多糖粗品质量(g)；多糖含量即粗多糖中多糖所占百分比(%)；样品质量即油茶籽饼粕质量(g)。

1.2.3酶的种类对油茶籽饼粕多糖得率的影响。分别加入中性蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶及果胶酶，固定酶解温度50 ℃，酶解时间60 min，酶添加量1.0%，考察酶的种类对油茶籽饼粕多糖得率的影响。

1.2.4单因素试验。固定酶解时间60 min，酶添加量1.0%，考察酶解温度(30、40、50、60、70 ℃)对多糖提取率的影响；固定酶解温度50 ℃，酶添加量1.0%，考察酶解时间(30、60、90、120、150 min)对多糖提取率的影响；固定酶解温度50 ℃，酶解时间90 min，考察酶添加量(0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)对多糖提取率的影响。

1.2.5响应面试验设计。根据酶解单因素试验结果，以酶解温度、酶解时间、酶添加量作自变量，以多糖提取率为响应值，采用软件Design-Expert 8.05的Box-Behnken试验设计响应面法优化中性蛋白酶酶解提取工艺，试验因素水平见表1。

表1　Box-Behnken试验设计因素水平

2结果与分析

2.1酶的种类对油茶籽饼粕多糖得率的影响由图1可知，以纵坐标粗多糖得率为考察指标，进行酶的筛选。结果显示，加入中性蛋白酶，粗多糖得率最高。可能是因为中性蛋白酶能有效降解与多糖结合在一起的蛋白质，从而释放出更多的多糖，且经粗多糖脱蛋白的过程，也能更多去除粗多糖中的蛋白质，进一步提高多糖的纯度。

图1　酶的种类对油茶籽饼粕多糖得率的影响Fig.1　Effects of enzyme type on the extraction rate of polysaccharides from camellia seed cake

2.2单因素试验结果分析

2.2.1酶解温度对多糖提取率的影响。由图2可知，酶解温度对油茶籽饼粕粗多糖提取率影响显著，酶解温度对粗多糖得率的影响呈现先上升后下降的变化。当酶解温度为50 ℃时，酶解效果最好，粗多糖得率最高。当温度超过50 ℃，部分酶开始失活，粗多糖得率开始下降。由此可知，中性蛋白酶最适温度为50 ℃，故选择40、50、60 ℃作为响应面试验中酶解温度的3个考察水平。

图2　酶解温度对多糖得率的影响Fig.2　Effects of enzymolysis temperature on the extraction rate of polysaccharides

2.2.2酶解时间对多糖得率的影响。由图3可知，酶解时间对油茶籽饼粕粗多糖得率影响较小，随着酶解时间的增加，多糖溶液的吸光值一直处于上升趋势，粗多糖得率逐渐增加。在酶解时间30～90 min，多糖得率的增加趋势明显，而在酶解时间90～150 min，多糖得率的增加趋势趋于平缓。故从工艺和经济成本2个方面考虑，选取60、90、120 min作为响应面试验中酶解时间的3个考察水平。

图3　酶解时间对多糖得率的影响Fig. 3　Effects of enzymolysis time on the extraction rate of polysaccharides

2.2.3酶添加量对多糖得率的影响。由图4可知，酶添加量对油茶籽饼粕粗多糖提取率影响较大，在酶添加量0%～1.5%，粗多糖得率逐渐增加，而在1.5%～2.0%增加幅度平缓。因此，从提取率和经济成本2个方面考虑，选取1.0%、1.5%、2.0%作为响应面试验中酶添加量的3个考察水平。

图4　酶添加量对多糖得率的影响Fig. 4　Effects of enzymolysis dosage on the extraction rate of polysaccharides

2.3响应面试验方案及结果分析

2.3.1响应面试验优化结果。通过单因素试验，选择合适的水平组合进行响应面试验，以确定最佳的粗多糖提取工艺。油茶籽饼粕多糖提取的Box-Behnken试验方案及结果见表2。

表2　Box-Behnken试验方案及结果

Design-Expert软件对所得试验结果进行拟合二次多项式模型的方差分析，获得酶解温度(A)、酶解时间(B)、酶添加量(C)的二次多项回归方程为：Y=0.23-0.034A+0.013B+0.03C-0.011AB-0.024AC+0.008BC+0.027A2+0.003 375B2+0.007 625C2。由方差分析可知，模型P<0.000 1，模型显著，失拟项P=0.193 1，失拟项不显著。由F值可以看出，影响多糖得率的因素按主次顺序排列依次为A(酶解温度)、C(酶添加量)、B(酶解时间)。其中A(酶解温度)和C(酶添加量)达到极显著水平，A(酶解温度)与C(酶添加量)、A(酶解温度)与B(酶解时间)交互作用较明显，达到显著水平。综上所述，该模型拟合程度较好，模型成立。

2.4验证试验通过求解回归模型方程，得油茶籽饼粕多糖酶解的最佳工艺为酶解温度42.285 7 ℃，酶解时间118.851 2 min，酶添加量2.074 7%。考虑到实际操作的可行性，将各因素水平归整并进行验证试验，酶解温度40 ℃，酶解时间120 min，酶添加量2.0%，在此工艺条件下，油茶籽饼粕多糖得率为15.66%，是优化前得率7.65%的2.05倍，显著提高了多糖得率。因此，该优化工艺合理，具有可操作性，适宜用于油茶籽饼粕粗多糖的提取。

3结论与讨论

该试验通过酶法辅助热水浸提油茶籽饼粕多糖，发现采用中性蛋白酶提取效果最佳，可能是因为多糖易与饼粕中蛋白结合形成糖蛋白，中性蛋白酶能有效降解与多糖结合在一起的蛋白质，从而释放出更多的多糖，提高了多糖的得率，且更有助于粗多糖脱蛋白，进一步提高了多糖的纯度。针对此，通过验证试验表明，优选的酶法与传统热水浸提相结合工艺合理、提取率高、安全可靠，重复性好，适宜用于油茶籽饼粕粗多糖的提取。

该试验在单因素试验基础上，通过响应面试验设计，以多糖得率为考察指标，对油茶籽饼粕多糖的提取工艺进行了优化。影响多糖得率的因素按主次顺序排列依次为A(酶解温度)、C(酶添加量)、B(酶解时间)。确定油茶籽饼粕多糖提取最佳工艺为酶解温度40 ℃，酶解时间120 min，酶添加量2.0%，此条件下多糖得率为15.66%，是优化前得率的2.05倍，显著提高了多糖得率。因此，该优化工艺合理，具有可操作性。

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Optimization of Extraction of Polysaccharides from Camellia Seed Cake by Neutral Protease Using Response Surface Methodology

JIN Ri-sheng1,2, XU Bing-yan1, YUAN Chuan-xun1*

(1. Engineering Research Center of Bioprocess ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei, Anhui 230009; 2. Institute of Chemical Industry of Forest Products, Chinese Academy of Forestry Sciences, Nanjing, Jiangsu 210042)

Abstract[Objective] To improve the extraction rate of the polysaccharides from camellia seed cake. [Method] With camellia seed cake after oil manufacture as the research material, polysaccharides were extracted by pectinase hydrolysis combined with traditional hot water extraction. Effects of neutral protease, cellulase, hemicellulase and pectinas on the polysaccharide extraction rate were researched. Single factor test was carried out to research the effects of three factors (enzymolysis temperature, enzymolysis time and enzyme dosage) on the polysaccharides extraction rate. Response surface methodology was applied to optimize the optimal conditions. [Result] The optimal extraction technology was as follows:40 ℃ enzymolysis temperature, 120 min enzymolysis time and 2.0% enzyme dosage. Under these conditions, the average extraction rate of polysaccharides was 15.66%, which was 2.05 times before optimization (7.65%). [Conclusion] This method has high extraction rate of polysaccaride, and is a kind of effective method for polysaccharide extraction.

Key wordsCamellia seed cake; Polysaccharides; Enzyme method; Single factor test; Response surface methodology

作者简介金日生(1982- )，男，安徽桐城人，助理研究员，博士，从事天然活性物质研究与开发工作。

收稿日期2016-03-28

中图分类号S 789.7

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)11-107-03