柚皮素对缺血再灌注损伤心肌保护作用的机制研究

梅繁勃，王文妍，李冬梅，尹菲菲

柚皮素对缺血再灌注损伤心肌保护作用的机制研究

梅繁勃a，王文妍a，李冬梅b，尹菲菲c*

武警总医院a.干一科，b.药剂科，c.妇产科，北京 100039

[摘要]目的探讨柚皮素(NAR)对心肌缺血再灌注(MI/R)损伤的保护作用及其作用机制。方法通过结扎左冠脉前降支30 min，再灌注120 min，建立MI/R大鼠模型，随机分为NAR高、中、低剂量组(100、50、25 mg/kg)，假手术组，模型组，各10只。各组于术前1周开始腹腔注射给药，1次/d。再灌注后取血清，采用比色法测定肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性，ELISA法测定肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和白介素-1β (IL-1β)水平；取心脏，染色法测定心肌梗死面积；取心肌匀浆，测定髓过氧化物酶(MPO)活力。结果NAR高剂量组可使心肌梗死面积缩小至32.91%，与模型组(39.78%)比较差异有统计学意义(P<0.05)；NAR各剂量组血清CK、LDH活性均降低，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；NAR各剂量组心肌MPO活力均明显降低(P<0.05或P<0.01)；NAR高、中剂量均可降低血清TNF-α和IL-1β水平(P<0.05或P<0.01)，低剂量亦可降低血清IL-1β水平(P<0.05)。结论NAR预处理可保护MI/R所致心肌损伤，其机制与抑制中性粒细胞浸润、减少炎性细胞因子的释放等有关。

[关键词]柚皮素；心肌缺血再灌注损伤；大鼠；中性粒细胞浸润；炎症反应

0引言

柚皮素(Naringenin，NAR)属于类黄酮类化合物，广泛存在于枳实、化橘红、桃叶、菝葜等植物中，具有多种生物学活性和重要的药用价值，如降血糖、降血脂、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等[1-2]，在医药、保健等方面的应用前景广阔。近年研究证实，NAR对心肌缺血再灌注(Myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)损伤的心肌组织具有保护效应[3-4]，但机制尚不明确。本研究拟探讨NAR保护心肌的作用机制，以期为临床用药提供实验依据。

1材料与方法

1.1动物清洁级SD大鼠，雌雄各半，体重180～220 g，由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2008-1-003。

1.2药品和试剂NAR(纯度98%)购自Sigma-Aldrich公司，用1%二甲基亚砜(DMSO)配成所需浓度。氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、髓过氧化物酶(MPO)试剂盒、肌酸激酶(CK)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β (IL-1β) ELISA检测试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1造模参照文献[5]采用冠脉结扎法建立MI/R大鼠模型。取大鼠，术前12 h禁食不禁水，戊巴比妥钠35 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰位固定，四肢连接ECG-1350P型十二导联心电图机。颈部分离气管，插入气管插管，连接DW-3000型动物人工呼吸机(呼吸频率60次/min，潮气量2 mL/100 g)。顺肋间隙方向于胸骨左旁第3、4肋间开胸，分别在第3、4肋上环绕1根0号手术线，牵拉手术线使肋骨撑开，暴露心脏，沿左心耳下缘冠脉前降支起始部3～4 mm处用4-0带线缝合针穿过，进针深度控制在0.1 cm左右，将一小段直径1.5 mm的乳胶管置于结扎线下，收紧结扎线以造成心肌缺血，约30 min后(冠脉结扎成功的标志：心电图ST段明显抬高或T波高耸)，松开结扎线再灌注120 min (再灌注成功的标志：抬高的ST段下降1/2以上或高耸的T波下降)。结扎前心电图不正常者，未到观察终点而死亡者及造模不成功者剔除。

1.3.2分组给药将成模大鼠随机分为NAR高、中、低剂量组(100、50、25 mg/kg)[3]及模型组，每组10只。另取10只大鼠，开胸但不结扎冠脉，作为假手术组。各组于术前1周开始腹腔注射给药，1次/d，假手术组和模型组腹腔注射等体积1% DMSO。

1.3.3检测血清心肌酶活性和细胞因子水平再灌注结束后，各组动物由股动脉采血，2 500 r/min离心10 min分离血清，采用比色法测定OD值，计算CK、LDH活性；采用ELISA法检测TNF-α、IL-1β的表达水平，具体步骤按试剂盒说明书进行。

1.3.4检测心肌梗死面积取心脏，用PBS缓冲液洗后，在冠脉结扎线下，从心尖起将心室平行切成厚度相等的5片，放入0.1% NBT溶液中，37 ℃染色15 min。梗死心肌呈灰白色，正常心肌则呈蓝色，图像采集后，通过软件ImagePro Plus 7.0测算梗死区面积和心室总面积，计算心肌梗死面积(%)[6]。

1.3.5检测心肌MPO活力取部分心脏制成匀浆，3 500 r/min离心10 min得上清，采用比色法测定OD值，并计算MPO活力，具体步骤按试剂盒说明书进行。

2结果

2.1各组心肌梗死面积比较假手术组梗死面积为0，未纳入统计学比较；模型组大鼠心肌梗死面积达39.78%，NAR高剂量组心肌梗死面积缩小至32.91%，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1　各组心肌梗死面积比较(n=10)

2.2各组心肌酶活性比较假手术组大鼠血清CK、LDH活性分别为179.30、596.90 U/L，模型组大鼠血清CK和LDH活性分别升至809.45、2 034.56 U/L，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)；NAR高、中、低剂量组血清CK、LDH活性分别降至621.89、650.12、658.03 U/L和1 326.97、1 506.27、1 543.08 U/L，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见图2。

图2　各组血清CK、LDH活性比较(n=10)

2.3各组中性粒细胞浸润比较假手术组大鼠心肌MPO活力为53.76 U/g，MI/R损伤模型组大鼠心肌MPO活力升至423.9 U/g，与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.01)；NAR各剂量组心肌MPO活力分别降至330.54、322.74、280.64 U/g，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见图3。

图3　各组心肌MPO活力比较(n=10)

2.4各组血清炎性细胞因子比较假手术组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平分别为41.55、90.94 pg/mL，模型组血清TNF-α、IL-1β的表达水平分别升至158.32、500.78 pg/mL，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，NAR高剂量组血清TNF-α、IL-1β水平降至120.10、400.14 pg/mL (P<0.01)，NAR中剂量组降至125.87、409.87 pg/mL (P<0.05)，NAR低剂量组血清IL-1β水平降至420.91 pg/mL (P<0.05)。见图4。

图4　各组血清TNF-α和IL-1β的表达水平比较(n=10)

3讨论

采用“药物预处理”防治MI/R损伤已成为近年来的研究热点。药物预处理通过促使机体释放生物活性物质或直接激活内源性保护机制，增强心脏对缺血、缺氧的耐受[7]。本研究采用预处理的方式观察NAR对MI/R损伤大鼠的影响，结果表明，NAR (100 mg/kg)能显著缩小心肌梗死面积(P<0.05)。有研究表明，作为存在于心肌细胞中的蛋白酶，血清CK、LDH水平与心肌坏死程度呈正相关[8]，可作为反映MI/R损伤程度的诊断标准之一[9]。本研究结果表明，NAR预处理可显著抑制血清CK、LDH活性，提示NAR可通过提高细胞膜的稳定性而发挥心肌保护作用。

以中性粒细胞浸润为主的炎症反应是造成缺血再灌注损伤的重要因素之一[10]，抑制中性粒细胞有可能成为防治MI/R损伤的有效措施[11]。MI/R发生时，激活的中性粒细胞聚集到心肌组织，通过一系列病理机制造成心肌细胞的损伤和功能的丧失，如：释放炎性介质、细胞毒性产物，直接损伤心肌；黏附于微循环，阻塞毛细血管，造成“无复流现象”；释放氧自由基，增强脂质过氧化反应，导致内皮细胞功能障碍等[12]。本研究显示，大鼠MI/R心肌组织的中性粒细胞含量较正常心肌组织显著升高，且在再灌注120 min时达到峰值[13]。MPO酶为中性粒细胞所特有，通过分析该酶的活力，可判断中性粒细胞浸润的程度。本研究结果表明，缺血再灌注后MPO活性显著升高，提示中性粒细胞浸润明显；NAR预处理可使心肌MPO活性明显下降(P<0.05或P<0.01)，提示NAR可通过抑制心肌内中性粒细胞浸润、减轻炎症反应来保护受损的心肌组织。

MI/R损伤是一个包括中性粒细胞活化、多种细胞因子过度表达、伴有多种炎性介质参与的复杂过程。TNF-α是MI/R炎症连锁反应中的一个关键性介质，心肌细胞在缺血后再灌注的刺激下可合成和分泌大量TNF-α[14]。TNF-α本身具有细胞毒作用，可通过不同途径导致心肌细胞受损，甚至溶解、死亡；TNF-α能刺激血管内皮细胞和中性粒细胞表达黏附分子，反之，黏附分子促进中性粒细胞聚集并释放活性氧和蛋白水解酶等物质，导致心肌微血管阻塞，加重MI/R心肌损伤的程度[15]。研究显示，大鼠MI/R损伤早期心肌组织及血清中TNF-α明显表达，峰值出现在再灌注2～4 h[16]。IL-1β作为一种急性炎症因子，广泛参与感染、应激及缺血再灌注等过程。IL-1β处于炎症级联反应上游，MI/R损伤早期即有IL-1β产生[17]；IL-1β同样能刺激血管内皮细胞表达黏附分子，加重缺血组织的炎症反应；抑制IL-1β的产生和释放，则可减轻MI/R损伤的程度[18]。在大鼠MI/R模型中应用脂质体转染过度表达IL-1β受体拮抗剂，可减轻心肌组织的炎症浸润和细胞凋亡[19]，证明IL-1β参与MI/R过程中的炎症反应和心肌细胞凋亡。本研究结果表明，冠脉结扎30 min再灌注120 min后，血清TNF-α、IL-1β水平明显升高，提示其参与了MI/R损伤的过程，加重心肌组织的灌注障碍；NAR高、中剂量组血清TNF-α、IL-1β水平及NAR低剂量组血清IL-1β水平较模型组显著降低(P<0.05或P<0.01)，提示NAR预处理可减少炎性细胞因子的生成，抑制MI/R损伤中的炎症反应。

综上，NAR预处理对MI/R损伤的心肌保护作用是通过抑制中性粒细胞浸润、下调炎性细胞因子释放、缓解MI/R过程中的炎症反应等途径实现的。

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Protective mechanisms of naringenin against myocardial ischemia/reperfusion injury

MEI Fan-boa,WANG Wen-yana,LI Dong-meib,YIN Fei-feic*

(a.Department of Cadre Ward,b.Department of Pharmacy,c.Department of Gynaecology and Obstetrics,General Hospital of Armed Police Forces,Beijing 100039,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the protective mechanisms of naringenin (NAR) against myocardial ischemia/reperfusion (MI/R) injury.MethodsRat model of MI/R injury was established by coronary artery ligation for 30 min followed by 120 min reperfusion.Then rats were divided randomly into 5 groups (n=10):sham group,model group and NAR groups (100,50 and 25 mg/kg).NAR was administered by intraperitoneal injection once daily for 7 d before operation.The activities of CK and LDH and levels of TNF-α and IL-1β were examined by colorimetric and ELISA method respectively after reperfusion.The area of myocardial infarction was calculated and MPO activity in heart homogenate was detected.ResultsHigh dose of NAR significantly reduced the area of myocardial infarction to 32.91%,which was better than that of model group (39.78%).The activities of CK and LDH in NAR groups were lower than those of model group (P<0.05 or P<0.01).NAR evidently reduced the MPO activity in heart homogenate (P<0.05 or P<0.01).The levels of TNF-α and IL-1β in NAR groups (100,50 mg/kg) were lower than those of model group (P<0.05 or P<0.01),and 25 mg/kg of NAR inhibited the IL-1β level in serum too(P<0.05).ConclusionThe effect of NAR pretreatment on MI/R injury appears to be associated with the inhibition of neutrophil infiltration and expression of inflammatory cytokines.

Key words：Naringenin;Myocardial ischemia/reperfusion injury;Rat;Neutrophil infiltration;Inflammation reaction

收稿日期：2015-09-01

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201605004