超声辅助合成玉米醇溶蛋白-糖接枝物的研究

赵　卓，袁　媛，肖志刚，解梦汐（.沈阳师范大学化学化工学院，辽宁沈阳　0034；.沈阳师范大学粮食学院，辽宁沈阳　0034）



超声辅助合成玉米醇溶蛋白-糖接枝物的研究

赵卓1，袁媛2，*肖志刚2，解梦汐1
（1.沈阳师范大学化学化工学院，辽宁沈阳110034；2.沈阳师范大学粮食学院，辽宁沈阳110034）

摘要：以自制玉米醇溶蛋白为原料，采用超声辅助加热方式对玉米醇溶蛋白进行湿法糖接枝反应，并对接枝物功能性及结构进行研究。结果表明，随着加热时间的延长，接枝物溶解性有了不同程度的提高，玉米醇溶蛋白-葡萄糖在超声时间30 min的溶解度提高了近86.2倍，达到27.22%；乳化性及乳化稳定性也有明显改善。对相同反应条件下的玉米醇溶蛋白而言，接枝物表面疏水性有所下降，且玉米醇溶蛋白与葡萄糖接枝物的下降更为显著。FTIR分析表明，玉米醇溶蛋白以共价键方式结合糖分子。SEM结果表明，接枝物结构与玉米醇溶蛋白明显不同。

关键词：玉米醇溶蛋白；糖接枝；功能性；结构

0　引言

玉米醇溶蛋白是玉米淀粉经过深加工处理后的主要副产物之一，约占玉米蛋白的45%～50%［1］。由于其具有较高表面疏水性和脂肪酸结合能力，以及缺乏赖氨酸、色氨酸等必需氨基酸导致其不溶于水、功能性较差，限制了在食品工业中的应用［2-3］。为了扩大其利用范围，提高利用价值，国内外学者在探究玉米醇溶蛋白方面做了大量研究，但主要是提取工艺条件方面的优化。另外，研究最多的是其成膜性和在纤维方面改性的利用［4-5］。也有学者对其功能性进行了研究，主要是化学性和酶改性，含有较多化学试剂，可能会造成污染［6］。

近年来，通过蛋白质-糖接枝反应改善蛋白质功能性质得到了越来越多的关注，该反应是以美拉德反应为基础，不需要加入任何催化剂，仅加热便可自发反应。研究表明，利用糖接枝可以显著提高蛋白质的溶解性、乳化性、起泡性、热稳定性和抗氧化性等［7-8］。目前，糖接枝反应主要有干法和湿法改性，但是反应周期长，不利于应用。Guan等人［9］采用微波加热合成大豆分离蛋白-糖的接枝物，加速了反应时间，功能性得到了较大改善；张智刚等人［10］对米蛋白-葡聚糖进行了微波加热接枝的工艺研究。目前，关于玉米醇溶蛋白糖接枝改性还鲜有报道。

本文以玉米醇溶蛋白为原料，糖基供体选取葡萄糖和麦芽糊精，采用超声波辅助加热方式，对玉米醇溶蛋白进行糖接枝改性，并研究了接枝物的功能性及其结构。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1 试验材料

玉米蛋白粉，大连奥肽动物营养有限公司提供；葡萄糖、麦芽糊精，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司提供；赖氨酸、十二烷基磺酸钠（SDS）、β-巯基乙醇、邻苯二甲醛（OPA）等均为分析纯；透析袋（截留相对分子质量8 000～12 000 Da）。

1.1.2主要仪器设备

UV- 9000型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司产品；HH S4型恒温水浴锅，江苏金坛亿通电子有限公司产品；低速冷冻离心机，贝克曼库尔特有限公司产品；冷冻干燥机、超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；扫描电镜，日本Hitachi公司产品。

1.2试验方法

1.2.1玉米醇溶蛋白的提取工艺

1.2.2玉米醇溶蛋白-糖接枝物的制备

称取一定量的玉米醇溶蛋白，溶解于0.2 mol/L （pH值12）的KCl- NaOH缓冲液中，于恒温水浴中磁力搅拌30 min，使蛋白均匀分散开。然后，按配比为1∶2加入葡萄糖或麦芽精糊，磁力搅拌20 min，使玉米醇溶蛋白与糖充分混匀，并调至适宜的反应温度，放入超声仪器反应一定时间。待反应完成后，立即冰浴冷却到室温，取10 mL反应后的混合液保存在冰箱中，剩下的反应混合物于4℃蒸馏水中透析24 h，将所透析的溶液冷冻干燥成粉末。

1.2.3接枝度的测定

采用邻苯二甲醛（OPA）法测定自由氨基的含量［11］。精确称取80.0 mg OPA溶解于2 mL甲醇中，再加入5.0 mL 20%SDS，50.0 mL硼砂（0.1 mol/L）及200 μL的β-巯基乙醇，最后用蒸馏水定容至100 mL。测定时，取8.0 mL的OPA，分别加入400 μL蒸馏水和样品混匀于试管中，置于35℃水浴中反应2 min后于340 nm下测定吸光度。以0.1～0.5 mg/mL的赖氨酸制作标准曲线，计算样品中自由氨基的含量。

接枝度（DG）按式（1）计算：

式中：C0——零时刻时单一蛋白质溶液中游离氨基含量；

Ct——t时刻接枝物溶液中游离氨基的含量。

1.2.4溶解度的测定

精确称取一定量的玉米醇溶蛋白及其接枝物溶于蒸馏水中，调节蛋白质质量浓度为1 mg/mL，在常温下搅拌30 min后，以转速5 000 r/min离心10 min，收集上清液。利用双缩脲法测定上清液中蛋白质含量［12］，以牛血清白蛋白做标准曲线。

1.2.5乳化性及乳化稳定性的测定

参照Pearce和Kinsella［13］的方法并稍作改动。取15 mL蛋白质量浓度为1 mg/mL待测样品液（样品溶于0.2 mol/L pH值7.5磷酸缓冲液中），加入5 mL大豆色拉油，在高速分散机以转速12 000 r/min，25℃下分散1 min，分别于0 min和10 min时迅速从溶液底部取100 μL乳浊液，加入到10 mL 0.1%的溶液中，用振荡混匀器混匀，立即于500 nm处测定吸光度，以SDS溶液为对照。0 min时测定的吸光度A0，作为乳化活性（EA）。

乳化稳定性按式（3）计算：

式中：A10——10 min时于500 nm处测得的吸光度。

1.2.6表面疏水性的测定

采用ANS荧光探针法测定表面疏水性。将玉米醇溶蛋白和通过不同处理的接枝物溶解于0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值7.0），在室温条件下搅拌1.0 h后以转速10 000 r/min离心30 min，测定上清液中蛋白质量浓度，用磷酸盐缓冲液依次将蛋白样品稀释，保证梯度质量浓度为0.005～0.200 mg/mL，试验中激发波长λex为390 nm，发射波长λem为470 nm。取不同梯度的蛋白溶液4 mL，分别加入40 μL用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值7.0）配制的最终浓度为8.0 mmol/L ANS溶液，经暗处振荡快速混合均匀，迅速测定其混合液的荧光强度（FI）。以荧光强度对蛋白质量浓度作图，初始段斜率即为蛋白质分子的表面疏水指数。

1.2.7傅里叶红外光谱（FTIR）分析

红外光谱测试采用溴化钾（KBr）压片法，称取玉米醇溶蛋白及接枝物样品1 mg，加入溴化钾100 mg，研磨混匀，压片后进行测定。室温条件下，设置红外光谱仪的波数谱段范围为4 000～400 cm-1，设定分辨率为4 cm-1，扫描32次［14］。

1.2.8扫描电子显微镜（SEM）分析

将烘干至恒质量的不同处理玉米醇溶蛋白及接枝物样品，用双面胶在红外线灯下固定于样品台上，观察前用离子喷射器在表面喷15 nm的金箔。测试时，将样品置于扫描电子显微镜中观察，拍摄具有代表性的样品颗粒形态。

2　结果与讨论

2.1超声强化玉米醇溶蛋白-糖接枝度（DG）的影响

接枝度是作为反映蛋白质与糖程度的一个极其重要指标。影响蛋白质与糖接枝的原因有蛋白质质量浓度、蛋白质与糖的质量比、反应温度、反应pH值等。除此之外，接枝反应时间也是其重要因素之一，随着热处理时间的延长，反应体系的内部会产生一系列复杂的变化，从而影响产品的性质。

超声时间对糖基化产物接枝度的影响见图1。

图1　超声时间对糖基化产物接枝度的影响

由图1可看出，玉米醇溶蛋白与糖的接枝反应度总体上呈现先升高后下降的趋势。这可能是由于超声产生的气泡空穴效应和机械效应导致蛋白链结构的展开，使其内部结构断裂开，变得疏松，增加了蛋白与糖的碰撞机会，从而使得接枝度迅速增加［15］。而随着超声时间的延长，一些蛋白小分子又重新集聚起来，自由氨基端被包埋，反应几率减少，造成接枝度降低。同时，由于葡萄糖分子较小、分子链较短、还原性较强，可以提供更多的还原羰基，能快速自由地与玉米醇溶蛋白反应，所以与玉米醇溶蛋白的接枝反应速度和程度明显高于麦芽糊精。麦芽糊精较低的反应活性与其大分子量的空间阻碍有关。这表明超声辅助加热玉米醇溶蛋白-糖接枝反应程度与糖分子的大小、形状及其还原性关系。

2.2溶解度分析

溶解度不仅是蛋白质最基本的功能性质之一，而且是其他功能性质良好的前提。玉米醇溶蛋白通过超声辅助加热进行糖接枝改性后，由于糖分子链段亲水性羟基的引入，糖分子羟基上的氢键结合能力改变了原来蛋白质的表面疏水性质，使得玉米醇溶蛋白溶解度显著提高。亲水性多糖的键合可以提高蛋白质和水分子之间的亲合性，并且抑制蛋白质分子在极端条件下的相互聚集作用。

超声时间对玉米醇溶蛋白和接枝物溶解度的影响见图2。

由图2可看出，在超声时间30 min时，玉米醇溶蛋白-葡萄糖接枝物溶解度提高了86.2倍，达到了27.22%。玉米醇溶蛋白-葡萄糖和玉米醇溶蛋白-麦芽糊精接枝物的溶解度均随接枝度的升高而表现出增加的趋势，但玉米醇溶蛋白-葡萄糖溶解度较高，是因为其与麦芽糊精的接枝物分子量较大，其接枝物空间位阻较大，从而溶解度低于玉米醇溶蛋白-葡萄糖。随着超声时间的延长，超声辅助处理又使玉米醇溶蛋白分子内部疏水性残基暴露出来，造成其溶解度降低。

图2　超声时间对玉米醇溶蛋白和接枝物溶解度的影响

2.3乳化性及乳化稳定性分析

超声时间对玉米醇溶蛋白和接枝物乳化性的影响见图3，超声时间对玉米醇溶蛋白和接枝物乳化稳定性的影响见图4。

图3　超声时间对玉米醇溶蛋白和接枝物乳化性的影响

图4　超声时间对玉米醇溶蛋白和接枝物乳化稳定性的影响

由图3和图4可看出，玉米醇溶蛋白接枝物与对照组相比，乳化性和乳化稳定性显著提高。玉米醇溶蛋白-麦芽糊精乳化性随超声时间的延长有所上升，而在60 min时有所下降，这可能是因为溶解度下降的缘故，玉米醇溶蛋白-葡萄糖乳化性随超声时间的延长上升并趋于相对平稳。从总体上看，玉米醇溶蛋白-麦芽糊精乳化性要优于玉米醇溶蛋白-葡萄糖。有研究报道，氮溶解指数是决定蛋白质乳化特性的主要因素［16］。这可能是因为一方面麦芽糊精分子链较长，黏度较葡萄糖大，所形成的接枝物黏度也较大，可得到较好的乳化性；另一方面，也可能是由于玉米醇溶蛋白-葡萄糖接枝度较高，故形成的复合物亲水性太大，则接枝物的乳化性较低。

Shu等人［17］研究表明，适当糖链长度的增加可以改善蛋白质的乳化性能。玉米醇溶蛋白-麦芽糊精乳化稳定性先随超声时间增加而后趋于稳定，而与葡萄糖接枝物在45 min后有所下降。这可能是由于麦芽糊精具有较大的分子量和分子间的空间位阻；另一方面，蛋白质分子的侧链也具有一定的疏水性，从而使接枝物较易吸附在蛋白质油水界面，表现出较大的屈服应力［18］。试验采用分子量较低、空间位阻较小的葡萄糖和蛋白质反应的接枝物不能提供足够强的稳定空间。因此，玉米醇溶蛋白-葡萄糖稳定性较差。

2.4表面疏水性分析

表面疏水性（H0）是衡量蛋白质表面疏水性基团数目的一个重要指标，主要用来评定蛋白质的空间构象。由于环境的改变使得蛋白分子结构的展开，而会使分子内部更多的疏水基团和区域暴露于周围的环境里。

玉米醇溶蛋白和接枝物表面疏水性见图5。

图5　玉米醇溶蛋白和接枝物表面疏水性

由图5可看出，未经超声处理过的玉米醇溶蛋白具有较低的表面疏水性指数（H0）。这是由于蛋白质通过疏水相互作用团聚的疏水性基团，包埋于分子内部而造成的。而经过超声热处理和超声辅助糖接枝后，表面疏水性指数（H0）迅速增加，这表明超声处理会使疏水基团不断暴露于溶液当中。同时，从图5还可看出，玉米醇溶蛋白-葡萄糖和玉米醇溶蛋白-麦芽糊精接枝物的H0，均比经过同等条件下处理的玉米醇溶蛋白小。这是因为蛋白质与糖接枝集聚后，亲水性羟基的键入使其亲水性得以提高。接枝度的增加，会降低蛋白质的表面疏水性，这可能是同一条件下，玉米醇溶蛋白-葡萄糖的H0比玉米醇溶蛋白-麦芽糊精小的原因。Zhang［19］报道了β-球蛋白-葡聚糖接枝物经由糖接枝后的H0低于仅加热的β-球蛋白，但同时也高于原样蛋白。在此试验中，玉米醇溶蛋白在超声45 min后，表面疏水性指数将近是原样玉米醇溶蛋白的6倍，而接枝反应在超声时间60 min时，其表面疏水性则有所降低，这可能是由于在热处理与超声的共同作用下，引起蛋白体的集聚而导致的结果。

2.5FTIR分析

玉米醇溶蛋白和接枝物FTIR图谱见图6。

图6　玉米醇溶蛋白和接枝物FTIR图谱

当蛋白质与糖共价结合后，红外图谱上表现出的一个典型特征是在1 260～1 000 cm-1出现吸收及在3 700～3 200 cm-1出现一个宽峰，分别归属于羟基和碳氧键的伸缩振动。由图6可看出，接枝物在3 700～3 200 cm-1及1 260～1 000 cm-1吸收均强于玉米醇溶蛋白，特别是玉米醇溶蛋白-麦芽糊精接枝物在1 260～1 000 cm-1有很强的吸收，这是由于O- H面内变性振动产生的。由此可知，玉米醇溶蛋白以化学共价键结合了糖分子。

2.6SEM分析结果

玉米醇溶蛋白及其接枝物SEM图谱见图7。

由图7可看出，玉米醇溶蛋白和接枝物的微观结构明显不同，玉米醇溶蛋白呈球状，经超声处理后，分子间断开，聚集成为小分子；而其接枝物呈片状结构，并且分散开来，特别是玉米醇溶蛋白-麦芽糊精接枝物。这是因为超声使分子间肽链伸展开，又由于糖分子的空间阻碍作用，使玉米醇溶蛋白与糖共价结合后，分子散开，减少了分子聚集。这与管军军［14］的研究结果一致。

3　结论

试验采用超声辅助的方式合成了玉米醇溶蛋白接枝物，对其蛋白接枝物的功能性及其结构进行了分析讨论，并且与玉米醇溶蛋白进行了对比。

图7　玉米醇溶蛋白及其接枝物SEM图谱

玉米醇溶蛋白经过糖接枝改性后，其接枝共聚物的溶解度有了很大提高，在超声30 min时，玉米醇溶蛋白-葡萄糖溶解度提高了近86.2倍，达到27.22%；接枝物的乳化性及其乳化稳定性也有了很大改善。玉米醇溶蛋白在与糖接枝后，其表面疏水性对比相同反应条件下的原样蛋白有所降低，且玉米醇溶蛋白与葡萄糖接枝物的下降程度更为显著。FTIR分析表明，玉米醇溶蛋白以共价键方式结合糖分子。SEM结果表明，接枝物结构与玉米醇溶蛋白明显不同。糖接枝改性是一种较好的改性方法，这也为玉米醇溶蛋白改性提供了一种新的改性思路，为拓展其应用领域提供一种新的技术支撑。

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Study of Zein- Saccharide Graft Reaction Products Prepared by Ultrasonic Treatment

ZHAO Zhuo1，YUAN Yuan2，*XIAO Zhigang2，XIE Mengxi1
（1. College of Chemistry and Chemical Engineering，Shenyang Normal University，Shenyang，Liaoning 110034，China；2. College of Grain Science and Technology，Shenyang Normal University，Shenyang，Liaoning 110034，China）

Abstract：Zein- saccharide graft reaction products are prepared by ultrasonic treatment. The functional properties and structure are studied. The results show that solubility is improved to different degree with the extension of the heating time as well as emulsifying properties. The solubility of zein- glu reached 27.22%，increasing by 86.2 times at 30 min. Surface hydrophobicity of grafts is lower than the control. Moreover，H0of zein- glucose decreased significantly. FTIR analysis demonstrated that zein is grafted with saccharide by covalent bonds. SEMresults indicat that structure of grafts is significantly different from zein.

Key words：zein；graft reaction；functional properties；structure

中图分类号：TS210.2

文献标志码：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.04.030

文章编号：1671- 9646（2016）04b- 0001- 05

收稿日期：2016- 03- 17

基金项目：国家星火计划重点项目（2015GA650007）；辽宁省“百千万人才工程”资助项目（2013921038）；沈阳市科技创新项目（F14104300）。

作者简介：赵卓（1990—），女，在读硕士，研究方向为植物蛋白与油脂。

*通讯作者：肖志刚（1972—），男，博士，教授，研究方向为粮食油脂及植物蛋白工程。