C- 反应蛋白全身性敲除大鼠模型的繁育及鉴定

葛欧洋，刘青，李晓曦，林艳，谭文，赵子建

(1.南京医科大学 代谢疾病研究中心，江苏 南京　210029; 2.华南理工大学

C- 反应蛋白全身性敲除大鼠模型的繁育及鉴定

葛欧洋1，刘青2，李晓曦1，林艳1，谭文2，赵子建1

(1.南京医科大学 代谢疾病研究中心，江苏 南京210029; 2.华南理工大学

生物科学与工程学院前孵化器中心，广东 广州510006)

[摘要]目的：繁育及鉴定C- 反应蛋白(CRP)全身性敲除的大鼠模型。方法：通过TALEN技术构建CRP敲除的杂合子大鼠，并将F1代雌鼠与雄鼠相互交配得到F2代大鼠。通过DNA测序以及ELISA法鉴定CRP敲除大鼠。结果：通过测序发现CRP敲除大鼠的CRP基因1#外显子缺失了TTGGT共5个碱基，ELISA结果显示CRP敲除大鼠中血清CRP含量较野生型相比下调98%。结论：成功构建了CRP全身性敲除大鼠，为后期CRP生物学功能的相关研究提供了动物模型。

[关键词]C- 反应蛋白； 全身性敲除； 繁育； 大鼠

C- 反应蛋白(CRP)首次被发现是在1930年，在体内主要是由肝脏合成[1]。它由5个24 kD顿原聚体(含206个氨基酸)以非共价连结成为五元体环形结构。CRP会结合在死亡细胞或微生物外膜上的磷酸胆碱(phosphocholine)，以活化补体系统。当体内有急性炎症、细菌感染、组织的损伤时，CRP的浓度会随着白介素- 6(IL- 6)的升高而升高。而IL- 6的升高又与某些炎症疾病的预后相关[2]。细胞学实验证明，CRP通过与凋亡细胞表面的溶血卵磷脂结合在C1Q复合物介导下激活补体系统[3]。CRP并不适用于单一疾病的诊断，它的临床价值主要在于组织损伤的筛检和监测，或者判断病人是否发炎以及诊断发炎性疾病的复发，除了肝脏衰竭的病人以外很少有干扰因素会影响CRP在血清中的浓度[4]。

自1997年起，美国布里根妇女医院的心脏学家瑞德克就注意到，一种和发炎有关的分子CRP与心脏病有关[5]。近年来的研究结果发现，在CRP基础水平升高的人群中糖尿病[6- 7]、高血压和心血管疾病的发病风险明显增加。同时，CRP还可作为肺动脉高压的预后判断指标[8]。一项关于冠心病的Meta分析涉及20项研究和1 466例患者，此外还有研究发现CRP可能是动脉粥样硬化的保护性蛋白。在体外试验中它可以结合到死亡细胞染色质和细胞碎片，因此推测它有阻止血小板聚集、减少血栓形成的作用。还有研究显示，CRP可以结合低密度脂蛋白(LDL)，通过吞噬细胞表面受体将LDL清除出动脉粥样硬化的斑块区[9]。

虽然有大量的临床研究证明CRP与炎症应答以及冠状动脉粥样硬化的发生有相关，但是却没有系统的功能方面的研究[10]。因此我们委托赛业生物有限公司用TALEN(transcription activator- like effector nuclease)的方法构建CRP敲除的大鼠，为研究CRP在各种相关疾病发生发展过程中的具体作用提供动物模型。

1材料与方法

1.1主要材料与试剂

大鼠基因组DNA提取与纯化试剂盒购自北京全式金生物科技公司。所用T4 DNA 连接酶、DNA聚合酶、Taq酶及 PCR 相关试剂主要购自TaKaRa公司。DNA Marker购自TaKaRa公司。大鼠CRP ELISA检测试剂盒购自默克密理博公司。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列见表1。所有敲除大鼠的遗传背景均为SD大鼠，大鼠CRP DNA序列查自NCBI网站。

表1大鼠CRP基因1#外显子引物序列

Tab 1Primer sequence of rat CRP exon 1#

引物序列引物FTGCCCTTGATCTTTCAGACAGAGC引物RACACAGTGAAGGCTTCCAGTGGC测序引物TGCCCTTGATCTTTCAGACAGAGC

所有大鼠置于温度(22±2)℃、湿度(60±5)%、12 h明暗交替环境中，基础饲料(购自北京维通利华实验动物有限公司)喂养。

1.2实验方法

1.2.1CRP全身敲除大鼠杂合子模型的构建TALEN质粒的构建、mRNA的体外合成以及mRNA原核显微注射均由赛业生物科技有限公司完成。

1.2.2CRP DNA片段测序使用引物F和引物R对CRP的1#外显子进行PCR扩增，得到444 bp左右的DNA片段，并委托广州艾基生物技术有限公司对该片段进行Sanger测序。

1.2.3CRP的ELISA检测将大鼠的血液离心后取血清，用1×的洗液将血清稀释4 000倍，在酶标板上每孔加入100 μl稀释后的样品，20～25 ℃孵育30 min后用洗板机洗板5次，每孔加入100 μl的酶标二抗，20～25 ℃孵育30 min后用洗板机洗板5次，每孔加入100 μl底物，20～25 ℃下避光显色5～10 min后每孔加入100 μl终止液。用酶标仪在吸光值450 nm处读取数据。

1.2.4大鼠体重的测定将3、5、8周龄的大鼠置于电子天平上，读数稳定后读取数值，称重 1 次。若有小数位，则按照“四舍五入”原则修约。

1.3统计学处理

2结果

2.1大鼠的基因型鉴定

将F1代大鼠中雄鼠与雌鼠进行交配得到F2代大鼠，用引物F和引物R对大鼠CRP基因的1#外显子进行PCR扩增，得到444 bp左右的片段。再将该片段进行Sanger测序，结果显示与WT大鼠相比CRP-/-和CRP+/-大鼠在其CRP基因1#外显子第90个碱基的位置缺少了TTGGT 5个碱基，与CRP-/-大鼠相比CRP+/-大鼠在第90个碱基的位置出现了两种不同的信号峰，所以判断为杂合子。见图1。

图1F2代大鼠的DNA测序图谱

Fig 1DNA Sequencing chromatogram of F2 generation rats

2.2大鼠血清CRP的ELISA检测

将大鼠的血清稀释后用大鼠CRP的ELISA试剂盒进行蛋白含量测定(每组5只大鼠)，CRP-/-大鼠血清中CRP的含量为(6.928±0.60) μg·ml-1；CRP+/-大鼠血清中CRP的含量为(202.2±29.29) μg·ml-1；WT大鼠血清中CRP的含量为(299.7±40.02) μg·ml-1。其中CRP-/-大鼠血清中CRP含量与WT大鼠相比下调98%，CRP+/-大鼠血清中CRP含量与WT大鼠相比下调28%。见图2。

2.3大鼠的体重测定

对3、5、8周龄左右CRP-/-大鼠进行称重，与WT组相比，其体重差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

3讨论

人类CRP的命名是由于该蛋白能与肺炎双球菌细胞壁的C多糖结合[11]。虽然编码CRP的基因具有一定多态性，但是CRP缺失的人却从未被报道过，这说明CRP在进化过程中极其保守，同时CRP在人类的生存中具有重要的作用。大鼠的CRP与人类的CRP在结构上具有高度的相似性，但是大鼠血清中CRP的水平在生理情况下的浓度要远高于人类和小鼠的CRP水平。另外一点与人类CRP不同的是，大鼠的CRP不会激活补体系统[12]。

a 与WT组相比,P<0.01

图23种基因型大鼠血清中CRP含量的测定

Fig 2The serum CRP levels in three genotypes rats

图32种基因型大鼠的体重

Fig 3The body weight of two genotypes rats

在C57BL/6小鼠中CRP敲除并不会影响小鼠的正常生长发育，这点与CRP敲除的大鼠相似，但CRP在正常小鼠生理情况下几乎不表达，而在正常大鼠生理情况下血液中含量则为300～600 μg·ml-1，这说明在大鼠体内CRP的功能与小鼠有所不同。此外有研究证明CRP并不会对小鼠的动脉粥样硬化产生促进或者保护的作用[13- 15]，但在肺炎双球菌以及LPS注射的情况下，CRP缺失小鼠的24 h死亡率明显高于对照组[16]，这说明CRP在小鼠急性感染的过程中起着至关重要的保护作用。而在CRP缺失的大鼠中是否也存在这样的现象还需要我们通过后续的实验进行进一步的研究。

CRP全身性敲除的杂合子大鼠之间相互交配能够正常生育纯子、杂合子以及野生型大鼠，说明CRP半敲除并不影响大鼠的生育功能。与野生型大鼠相比,在体重、毛色、体温、进食量方面也并没有表现出差异。本研究建立了CRP全身性敲除大鼠模型，为研究CRP提供了一个重要的实验平台，从而得以在整体动物水平面上研究CRP在不同组织器官中的作用，以及CRP在炎症反应、动脉粥样硬化等疾病发生发展过程中的生物学功能。CRP 作用机制的进一步探索必然会对临床上治疗糖尿病、心血管疾病以及感染性疾病产生深刻的影响。

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Breeding and identification of rat C- reactive protein knock out model

GE Ou- yang1，LIU Qing2，LI Xiao- xi1，LIN Yan1，TAN Wen2，ZHAO Zi- jian1

(1.CenterofMetabolicDiseaseResearch，NanjingMedicalUniversity，Nanjing210029，China; 2.Pre-IncubatorforInnovativeDrugandMedicine，SchoolofBioscienceandBioengineering，SouthChinaUniversityofTechnology，Guangzhou510006，China)

[Abstract]Objective： To breed and identify rat C- reactive protein (CRP) knock out models. Methods: The rat CRP knock out heterozygotes models were constructed with TALEN technology， and F2 generation was got by F1 generation copulation. The identification of rat CRP knock out was done by DNA sequencing and ELISA assays. Results: CRP knock out rats had five bases missing in their exon1#. The CRP level of the knock out rats displayed 98% reduction compared with the wild types. Conclusion: We have successfully constructed CRP knock out rat models, which is critical animals for the studies of biological functions of CRP．

[Key words]C- reactive protein; knock out; breeding rats

[收稿日期]2016- 01- 14[修回日期] 2016- 02- 29

[基金项目]科技部“973”重大科学研究计划项目(2013CB945200)

[作者简介]葛欧洋(1989-)，男，江苏南京人，在读硕士研究生。E- mail:goy11@163.com 刘青(1990-)，女，广东连县人，在读博士研究生。E- mail:liuqinggzsd@163.com并列第一作者

[通信作者]赵子建E- mail:azzhao@njmu.edu.cn

[中图分类号]R- 33

[文献标识码]A

[文章编号]1671- 6264(2016)03- 0346- 04

doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.03.012

[引文格式] 葛欧洋,刘青,李晓曦,等.C- 反应蛋白全身性敲除大鼠模型的繁育及鉴定[J].东南大学学报:医学版,2016,35(3):346- 349.

·论著·