山东省某猪场猪伪狂犬病的诊断鉴定及防治措施

刘 准，臧传佼，易新健，陈申秒，3*

（1.山东滨州沃华生物工程有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省病原微生物实验室，山东 滨州 256600；3.山东省博莱威生物技术研究所，山东 滨州 256606）

山东省某猪场猪伪狂犬病的诊断鉴定及防治措施

刘 准1，2，臧传佼1，易新健1，2，陈申秒1，2，3*

（1.山东滨州沃华生物工程有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省病原微生物实验室，山东 滨州 256600；3.山东省博莱威生物技术研究所，山东 滨州 256606）

为了确诊一起猪伪狂犬病的发生，采集送检病料的肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、脑等组织器官进行实验室诊断和PCR检测。结果显示，病料中扩增出了伪狂犬病病毒的特异性gE基因片段，通过对PCR扩增产物进行序列比对分析，发现此次发生的伪狂犬病与2011年之后流行的伪狂犬流行毒株高度同源。综合流行病学、病理解剖、实验室诊断，确定引起此次疾病的主要病原为猪伪狂犬病毒。

猪伪狂犬；流行毒株；诊断

伪狂犬病毒（PRV）是由疱疹病毒引起的可以多种动物共患的急性、热性传染病。病毒可以通过直接接触和间接接触在易感猪中传播，一般流行较快，发病较急。目前，疫苗免疫是防治本病的主要手段，猪场必须通过合理的疫苗免疫程序才能控制和消灭该病。但由于疫苗免疫不充分和疫苗不合理应用仍会造成该病的发生。自2011年以来，一种由伪狂犬病毒变异株引起的猪伪狂犬病在我国爆发，给我国养猪业造成了巨大的经济损失[1]。2016年2月，山东省广饶县某养殖场育肥猪群爆发疑似伪狂犬病，经流行病学调查、临床症状观察、病理剖检和实验室诊断，最终确诊本次疫情为猪伪狂犬病，现报道如下。

1 发病情况

据场主自述自2016年2月10号起，猪群中有猪只出现呼吸道症状，体温升高到41.5℃左右，之后大群陆续发病并出现呼吸道症状，当地兽医诊断为喘气病，让其拌料饲喂泰妙菌素和氟苯尼考等药物，同时对于食欲废绝的猪只注射头孢等抗生素，药物治疗后体温回降，但大群呼吸道症状一直未见好转，断断续续仍然有猪只死亡。发病猪日龄主要集中在4～5月龄的育肥猪，100头左右。其中圈舍中有三圈育肥猪症状较为严重，猪只趴伏不起，精神沉郁，采食减退或废绝。育肥猪群除在3日龄滴鼻猪伪狂犬病弱毒活疫苗，30日龄和60日龄分别免疫过2次猪瘟疫苗，其他疫苗均未免疫。猪群情况不容乐观。养殖场遂于3月1号携带2头病猪至沃华生物分子检测中心求诊，查找病因。

2 临床症状及剖检病变

病猪体温升高在41℃左右，精神不振，食欲减退或废绝。病猪呈典型的腹式呼吸，咳嗽，呼吸困难，病猪未见消瘦情况。其中，有1头病猪有典型的神经症状，盲目转圈，侧卧，四肢划水状。猪只死亡一段时间之后口鼻流出泡沫状带血的液体。

剖检病死猪两头，病理变化主要表现为腹股沟淋巴结肿大、充血，颌下淋巴结充血、肿胀、坏死（图1，A）；胸腔和腹腔有大量淡黄色透明状液体，肺脏高度水肿，呈黑红花斑状（图1，B）；扁桃体出血、溃疡严重（图1，C）；喉头会厌软骨出血（图1，D），气管内有白色泡沫，肝脏肿胀，表面有些灰白色的坏死灶；脾脏肿大（图1，E），肾脏肿大，脑有严重的充血积血（图1，F）。综合以上剖检症状，初步诊断为伪狂犬感染。

图1 病理剖检Fig.1 Pathologic autopsy

3 实验室诊断

3.1 细菌分离 无菌采取心包积液、肝脏、肺脏等进行细菌分离培养，接种在含小牛血清及NAD的TSA琼脂平板上培养24 h，结果无致病菌生长。

3.2 PCR诊断 采集猪的脑、肺脏、肝脏、脾脏、淋巴结等组织的病变部位，采用RT-PCR和PCR的方法检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒等病原。

3.2.1 引物设计 根据GenBank上公布的伪狂犬病毒基因设计合成1对gE基因特异性扩增引物。引物序列：P1：5’-GACCCCAAGCGCGCC-3’，P2：5’-CGCGTAGTACCAGTCCAGCGT-3’。

3.2.2 病毒DNA提取 采集脑、肝、脾、淋巴结、扁桃体等组织器官进行研磨匀浆，反复冻融3次后用OMEGA公司试剂盒（货号D3892-02）对病毒核酸进行提取。

3.2.3 PCR扩增 使用TaKaRa公司（货号DDR20AG）试剂盒进行PCR扩增。PCR反应体系（25 μL）：DNA 2 μL，2×GC buffer I 2.5 μL，MgCl2（25 μM）1.5 μL，dNTP（2.5 mM）2 μL，上游引物（10 μM）1 μL，下游引物（10 μM）1 μL，Taq 0.3 μL，ddH2O 14.7 μL。 PCR反 应 程 序 ： 94 ℃ 预 变 性5 min；94℃变性1 min、53℃退火30 s、72℃延伸1 min 30 s，共进行35个循环；72℃延伸10 min后4℃保存。

4 结果与分析

4.1 判定 实验室PCR检测结果（图2），除伪狂犬gE阳性外，其他CSFV、PCV-2、PRRSV等病毒结果阴性。综合临床及剖检症状，判断该猪群发病的主要原因是由猪伪狂犬病毒感染导致。

图2 PCR检测结果Fig.2 Results of PCR

4.2 gE基因的测序 对PCR扩增的目的片段进行连接、转化和测序，将测序结果与GenBank上国内外不同时间的毒株进行同源性分析，发现该毒株与2011年以后流行的毒株同源性高达99.5%，通过对gE基因构建遗传进化树发现，本次疫情所分离的毒株与2011年以后的国内的分离毒株亲缘关系较近，属于一个分支，与11年之前的国内分离到的一些经典毒株同属一个大分支，而与国外的一些毒株亲缘关系较远（遗传进化树如图3）。

5 防控措施

针对发病的猪群紧急接种伪狂犬弱毒疫苗2.5头份，同时在饮水中加入多维，连用7 d，以减少疾病带来的应激，在饲料中添加保肝护肾和黄芪多糖等中药，减轻疾病和前期用药对肝脏和肾脏的损伤，增强抵抗力，同时也有利于猪群后期的恢复。经过实地观察发现，疫苗免疫后2 d未见明显好转，发病后期的猪（主要为腹式呼吸的猪只）仍有个别死亡，第3天症状较重的三圈舍的育肥猪有几只可以自由活动，采食。其他圈舍咳嗽、气喘的猪只症状明显减轻。疫苗免疫后第5天，猪只大群状态基本正常，病情逐渐得到控制，总共死亡5头，死亡率为5%。由于判断及时准确，疫苗免疫后成功控制住病情的发展。

6 讨论

图3 遗传进化树Fig.3 Phylogenetic tree

2011年以来，新一轮的伪狂犬病疫情在我国大部分地区爆发，新的疫情主要是架子猪和育肥猪出现典型的呼吸道症状[2]。国内许多研究报道表明，我国目前大部分地区流行的伪狂犬病毒发生了变异[3-6]。哈尔滨兽医研究所通过对当前流行的伪狂犬病毒进行全基因组以及各基因序列进行比较分析，首次提出了伪狂犬病毒存在两个主要的基因型，并且两个基因型之间具有一定的地域性。欧美国家的毒株主要是基因Ⅰ型，亚洲国家的毒株主要是基因Ⅱ型，我国流行的伪狂犬毒株以基因Ⅱ型为主[7]。另外有研究报道，Bartha-k61株产生的中和抗体对目前变异毒株的中和能力远低于Bartha-k61株，表明伪狂犬变异毒株与经典强毒株和传统疫苗株存在一定的抗原差异[1，8-9]。在免疫保护方面，Bartha-k61株疫苗免疫后，用变异毒株进行攻毒，猪群出现发热、呼吸道症状和排毒，有部分猪只出现神经症状，但未出现猪群死亡现象[9-10]。

对于本次猪场爆发的伪狂犬病，通过对gE基因进行同源比较和遗传进化分析发现，引起猪场致病的野毒与2011年之后国内分离到的流行变异株有很高的同源性，为新的伪狂犬病变异毒株。另外通过对猪群紧急免疫伪狂犬弱毒活疫苗，很好的控制住猪场的疫情表明，经典株的疫苗仍能对变异株产生有效保护。对于防控目前流行的伪狂犬，增加经典株的接种次数，能够对猪群提供坚强持久的保护[11]。万遂如教授[12]指出猪场不合理的使用疫苗，降低疫苗的免疫频率，致使免疫空白期延长；另外，一些猪场频繁更换疫苗，有的猪场在两年时间更换了4个厂家的疫苗（双基因缺失疫苗、单基因缺失疫苗、弱毒活疫苗），在一定程度上为伪狂犬病毒的重组提供了条件，以上情况都给伪狂犬病毒的流行带来了很多风险。

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[10]Wang CH,Yuan J,Qin HY,et al.A novel gE-deleted pseudorabies virus(PRV)provides rapid and complete protection from lethal challenge with the PRV variant emerging in Bartha-K61-vaccinated swine population in China [J].Vaccine,2014,32:3379-3385.

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The diagnostic identification and prevention measures of Pseudorabies Virus from pig farm in Shandong Province

Liu Zhun1,2,Zang Chuanjiao1,Yi Xinjian1,2,Chen Shenmiao1,2,3
（1.Shandong Binzhou Wohua Biotech Co.,Ltd.,Shandong Binzhou 256600; 2.Shandong pathogenic microbiology laboratory,Shandong Binzhou 256600; 3.Shandong Bolaiwei Biological Technology Institute,Shandong Binzhou 256606)

To diagnose a suspected pseudorabies case,pathologic autopsy was performed and tissues of the pigs were collected for virus isolation and identification using PCR.The PRV gE gene was amplified from the tissues and its infection was confirmed.The swine Pseudorabies Virus was determined combined with epidemiology,anatomical pathology,laboratory diagnosis.The PCR product were analyzed by sequence alignment and showed that the isolate strain of this case shared highly homologous to the other strains that had been isolated after 2011,and confirmed the occurrence of this case was caused by a new wild pseudorabies virus.

Swine pseudorabies;Epidemic strain;Diagnose

S858.28

：B

：1672-9692(2016)09-0033-05

2016-07-20

刘准（1984-），男，山东莱阳人，硕士，研究方向：动物传染病的防控研究。

陈申秒（1983-），男，山东郓城人，硕士，助理研究员，研究方向：动物传染病的诊断与防治。