盐酸多西环素与土霉素对胸膜肺炎放线杆菌的体外抑菌效果研究

王德功，魏丽娟，杨国辉，刘 欣，吴聪明，贾国宾*

（1.河北远征药业有限公司，河北 石家庄 050041；2.河北省兽药工程技术研究中心，河北 石家庄 050041；3.中国农业大学，北京 100193）

盐酸多西环素与土霉素对胸膜肺炎放线杆菌的体外抑菌效果研究

王德功1，2，魏丽娟1，2，杨国辉1，2，刘 欣1，2，吴聪明3，贾国宾1，2*

（1.河北远征药业有限公司，河北 石家庄 050041；2.河北省兽药工程技术研究中心，河北 石家庄 050041；3.中国农业大学，北京 100193）

为研究盐酸多西环素、土霉素对胸膜肺炎放线杆菌的抗菌活性，本试验采用微量肉汤稀释法，对胸膜肺炎放线杆菌进行了体外药敏试验。结果显示，盐酸多西环素对胸膜肺炎放线杆菌的MIC范围为0.125～1.0 μg/mL，土霉素对胸膜肺炎放线杆菌的MIC范围为0.125～1.0 μg/mL，两种药物对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性相当。结果表明，盐酸多西环素和土霉素对胸膜肺炎放线杆菌具有良好体外抑菌作用。

盐酸多西环素；土霉素；胸膜肺炎放线杆菌；体外抑菌试验

多西环素（Doxycycline）与土霉素（Oxytetracycline）均属于四环素类抗菌药[1]，是临床上广泛应用的广谱抗生素[2]。多西环素又名强力霉素、脱氧土霉素，具有抗菌活性和组织穿透力更强、生物利用度高、体内分布广、半衰期较长等优点，在治疗大肠杆菌病、沙门氏菌病、巴氏杆菌病及支原体感染等方面效果显著[3]。土霉素对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体、衣原体、立克次体等引起的感染有效，也可用于治疗梨形虫病、附红细胞体病等[4]。

传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia，PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（APP）引起的猪的一种高度传染性呼吸道疾病，以急性出血和慢性纤维素性胸膜肺炎为特征，可造成患病猪死亡，在新进猪群中多呈急性爆发[5]。其发病率在10%以上，最急性型的死亡率可高达80%～100%[6]。随着养猪业规模化和集约化的发展，传染性胸膜肺炎已成为严重危害养猪业发展的主要细菌性传染病之一，给养殖业带来了极大的经济损失[7]。本试验旨在通过观察盐酸多西环素及土霉素对胸膜肺炎放线杆菌的体外抑菌活性，为临床药物合理使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受试药物 盐酸多西环素（原料药），含量84.50%，批号201312022，扬州联博药业有限公司。

土霉素（原料药），含量 90.20%，批号：141401074，赤峰制药股份有限公司。

1.1.2 对照药物 盐酸多西环素（标准品），含量85.20%，批号130485-201202，购自中国食品药品检定研究院。

土霉素（对照品），含量91.30%，批号K0031208（K0031208-01），购自中国兽医药品监察所。

1.1.3 试验菌株 胸膜肺炎放线杆菌，共计7株，均购自中国兽医药品监察所。这些菌株均分离自猪胸膜肺炎病例，由中国兽医药品监察所鉴定保存。

1.1.4 质控菌株 大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC29213，购自美国标准菌种收藏所（ATCC）。

1.1.5 培养基 MH肉汤培养基和MH琼脂培养基（质控菌用），批号分别为1211071和1302051；PPLO肉汤和PPLO琼脂（测试菌用），批号分别为1211071和1302051。上述试剂购自北京市陆桥技术有限责任公司。

1.2 试验方法 按微量肉汤稀释法进行，测试步骤参照CLSI（2013，VET01-S2）。具体操作如下。

1.2.1 药液配制 将盐酸多西环素、土霉素分别用灭菌蒸馏水配制成1 280 μg/mL的贮备液，过滤除菌，-20℃低温保存备用。

1.2.2 菌液制备 质控菌株（大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC29213）分别用MH肉汤复活，测试菌株（胸膜肺炎放线杆菌）用PPLO肉汤（添加1%NAD和5%猪血清）复活。质控菌株复活后接种于MH琼脂平板，测试菌株复活后接种于PPLO琼脂（添加1% NAD和5%猪血清）平板，37℃过夜培养后，分别挑取1～3个单菌落接种于MH肉汤或PPLO肉汤，置37℃孵育16～18 h。将原菌液用相应液体培养基按1:1 000稀释作为试验菌液。

1.2.3 接种培养 将两种药物贮备液分别用MH肉汤培养基（质控菌用）或PPLO肉汤（测试菌用）依次倍比稀释成 128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL，用微量加液器将稀释好的药液依次加入微孔板每排，每孔50 μL，第12孔加不含药物的培养基作为阴性对照。用微量加液器将试验菌液依次加入微孔板每排，每孔50 μL，这样每孔内药物的最后浓度为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.063 μg/mL，第12孔为不含药物的阴性对照。混匀，将微量板置于垫有湿纱布的搪瓷方盘内，置37℃培养18～24 h观察结果。

1.2.4 MIC判定 在衬有黑底板的光线下观察，细菌生长时小孔内培养液呈弥散状浑浊或U形底部有圆形或丝网状沉淀，无细菌生长孔的最低药物浓度即为该药物的MIC。

2 结果与分析

2.1 盐酸多西环素和土霉素对质控菌和测试菌的体外药敏试验结果见表1。数据显示，盐酸多西环素和土霉素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）在质控范围内（大肠杆菌0.5～2.0 μg/mL；金葡菌0.125～1.0 μg/mL），表明试验所用试剂（培养基）和操作方法合乎要求，检测数据可信。

2.2 数据可见，盐酸多西环素原料药对7株胸膜肺炎放线杆菌的MIC范围为0.125～1.0 μg/mL，盐酸多西环素标准品对7株胸膜肺炎放线杆菌的MIC范围为0.063～0.5 μg/mL。盐酸多西环素原料药和标准品对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性基本相当。

2.3 数据可见，土霉素原料药对7株胸膜肺炎放线杆菌的MIC范围为0.125～1.0 μg/mL，土霉素对照品对7株胸膜肺炎放线杆菌的MIC范围为0.063～1.0 μg/mL。土霉素原料药和对照品对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性也基本相当。

2.4 测定数据显示，盐酸多西环素对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性与土霉素相当。两种药物原料药的体外抗菌活性也与它们的标准品（或对照品）相当。且盐酸多西环素、土霉素对7株胸膜肺炎放线杆菌的MIC≤1 μg/mL，根据临床实验室标准化委员会（CLSI）的判定标准均为敏感。

表1 盐酸多西环素和土霉素对猪源胸膜肺炎放线杆菌的体外药敏检测结果Table1 In vitro susceptibility test results of doxycycline and oxytetracycline hydrochloride on porcine Actinobacillus pleuropneumoniae

3 讨论

3.1 胸膜肺炎放线杆菌属巴氏杆菌科嗜血杆菌属，后根据其表型和DNA杂交水平均与放线杆菌属模式种密切相关，归属为巴氏杆菌科放线杆菌属[8]，目前已报道的APP有15个血清型，15个血清型又分为生物Ⅰ型和生物Ⅱ型[9]。由于其血清型众多，具有地方特异性，同时各血清型之间也很难产生较强的交叉保护作用，疫苗免疫常常面临交叉保护作用不强的问题，影响其防控效果，所以抗菌药物成为控制这种病的主要手段[10]，临床上常用先锋霉素、阿莫西林、头孢噻呋、替米考星、四环素、氯霉素等治疗该病[11]。盐酸多西环素和土霉素作为临床上广泛应用的广谱抗生素，对胸膜肺炎放线杆菌具有良好的体外抑菌作用，因此开发用于防治猪胸膜肺炎放线杆菌感染的盐酸多西环素和土霉素制剂，有潜在的临床应用价值。

3.2 由于胸膜肺炎放线杆菌易产生耐药性[12]，随着临床生产实践中抗菌药物大量的使用，其耐药性也越来越严重。郭庆河[13]报道对新疆昌吉地区经过检测的9株APP进行药物敏感性检测，发现该细菌对盐酸多西环素敏感，其敏感率分别为77.8%；杨瑞晨[14]报道对来自四川广安、層山等地区疑似病料进行APP分离获得9株分离株进行药物敏感试验研究，结果表明9株分离株均四环素耐药；李海利等[15]报道对分离的7株APP进行药物敏感性试验，结果表明对四环素、盐酸多西环素耐药；本试验中盐酸多西环素、土霉素对胸膜肺炎放线杆菌的MIC范围均为0.125～1.0 μg/mL，处于敏感状态。但随着盐酸多西环素在临床中的广泛应用，菌株有可能会产生耐药。因此建议临床应加强分离菌的药物敏感性监测，以提高用药针对性，保证疗效。

参考文献

[1]朱模忠.兽药手册[M].北京：化学工业出版社，2002.

[2]Ya jaheikki J,Keinanen R,Pellikka M,et al. Minocycline blocks nitricoxideinduced neutrotoxicity by inhibition p38 MAP kinasein rat cerebelar granuleneurons. J Proc Natl Acad Sci USA,1998,95：15769-15774.

[3]李伟，杨阳.多西环素的药理学进展及临床应用概述[J].广东畜牧兽医科学，2009（6）：3-5.

[4]卢小春.防治细菌性传染病药物的合理应用[J].动物保健，2005（8）：33-34.

[5]TOBIAS T J,KLINKENBERG D,BOUMA A,et al.A cohort study on Actinobacillus pleuropneumoniae colonisation in suckling piglets[J]. Prev Vet Med,2014,114（3/4）:223-230.

[6]吴家强，李世平.猪接触传染性胸膜肺炎研究进展[J].畜牧与兽医，2002，34（10）：36-39.

[7]邹丽，周雪，徐登峰.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌鉴定与耐药性试验[J].中国兽医杂志，2014，50（2）：41-42.

[8]康帅，殷中琼，贾仁勇，等.乌梅等20种中药对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性研究[J].华南农业大学学报，2014，35（3）：13-17.

[9]李海利，朗利敏，徐引弟，等.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型PCR程序优化及分子鉴定[J].现代畜牧兽医，2015（1）：33-39.

[10]唐万勇，刘洁，侯博，等.氟苯尼考单用及联用对副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌的体外抑菌效果[J].中国猪业，2015（11）：85-88.

[11]唐文山，李昕.猪传染性胸膜肺炎研究进展[J].动物医学进展，2008，29（2）：98-102.

[12]张朝阳，刘二龙.猪传染性胸膜肺炎研究进展[J].中国畜牧兽医，2006，33（3）：36-39.

[13]郭庆河.新疆昌吉地区部分规模化猪场致断奶仔猪呼吸道综合征（PRDC）三种主要病原菌的分离鉴定及防治[D].乌鲁木齐：新疆农业大学，2013.

[14]杨瑞晨.胸膜肺炎防线杆菌四川分离株的生物学特性研究[D].雅安：四川农业大学，2015.

[15]李海利，郎利敏，徐引弟，等.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定及药敏试验[J].黑龙江畜牧兽医，2015（19）：179-181.

Studies on the Antibacterial Activity of Doxycycline Hydrochloride and Oxytetracycline against Actinobacillus Pleuropneumoniae in vitro

Wang Degong1,2,Wei Lijuan1,2,Yang Guohui1,2,Liu Xin1,2,Wu Congming3,Jia Guobin1,2*
（1.Hebei Yuanzheng Pharmaceutical Co.,Ltd,Hebei Shijiazhuang 050041; 2.Hebei provincial veterinary Engineering Technology Research Center,Hebei Shijiazhuang 050041; 3.China Agricultural University,Beijing 100193）

In order to study the antibacterial activity of doxycycline hydrochloride and oxytetracycline against Actinobacillus pleuropneumoniae,This experiment adopts the broth microdilution method of Actinobacillus pleuropneumoniae by drug sensitivity test in vitro.The results showed that the MIC of doxycycline hydrochloride against Actinobacillus pleuropneumoniae was 0.125～1.0 μg/mL,the MIC of oxytetracycline against Actinobacillus pleuropneumoniae was 0.125～1.0 μg/mL. The antimicrobial activity in vitro of the two drugs were equivalent against Actinobacillus pleuropneumoniae.The results show that doxycycline hydrochloride and oxytetracycline has good antibacterial activity against Actinobacillus pleuropneumoniae in vitro.

Doxycycline Hydrochloride;Oxytetracycline;Actinobacillus pleuropneumoniae;Antibacterial experiment in vitro

S855.12

：B

：1672-9692(2016)09-0016-04

2016-06-11

王德功（1981-），男，工程师，大学本科，学士，研究方向：药剂学及畜禽疾病。

贾国宾（1964-）男，大学本科，学士，高级工程师，研究方向：药剂学及畜禽疾病。

石家庄市科学技术研究与发展计划课题项目（131200083A）。