雪茄茄衣人工发酵过程中叶面微生物区系研究

杜　佳,　张晓娟,　吴　钢,　周瑞生,　崔宇慧,　时向东*

1.河南农业大学烟草学院, 郑州 450002;2.川渝中烟工业有限责任公司, 成都 610017;3.海南建恒哈瓦那雪茄有限公司, 海南 儋州 571700;4.中国烟草总公司海南省公司, 海口 570011



雪茄茄衣人工发酵过程中叶面微生物区系研究

杜佳1,张晓娟1,吴钢2,周瑞生3,崔宇慧4,时向东1*

1.河南农业大学烟草学院, 郑州 450002;2.川渝中烟工业有限责任公司, 成都 610017;3.海南建恒哈瓦那雪茄有限公司, 海南 儋州 571700;4.中国烟草总公司海南省公司, 海口 570011

摘要：在恒温恒湿箱内对海南光村茄衣发酵42 d，并对整个过程中烟叶表面微生物进行分离、纯化和鉴定，研究探讨了茄衣人工发酵过程中叶面微生物区系的变化。结果显示：在茄衣人工发酵过程中细菌为优势菌群，霉菌所占比例很小，没有检测出放线菌和酵母菌;所有细菌均为芽孢杆菌，数量由高到低依次是：巨大芽孢杆菌>枯草芽孢杆菌>蜡状芽孢杆菌>环状芽孢杆菌>蕈状芽孢杆菌>嗜热脂肪芽孢杆菌>短小芽孢杆菌>凝结芽孢杆菌;茄衣表面各菌种数量在发酵过程前24 d内呈急剧下降趋势；巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌为雪茄茄衣人工发酵中的优势菌种，分别占芽孢杆菌数量的50%以上和19%左右。

关键词：雪茄茄衣；人工发酵；叶面；微生物区系

雪茄烟的物理性质、化学成分和发酵方法工艺较烤烟有很大不同，同时由于种植地气候、品种、烟叶在工业上的用途(例如：茄衣、茄套和茄芯)不同，所要求发酵的具体技术参数也有很大差别[1]。雪茄茄衣调制下架后一般都要对其进行2～3次发酵来改善烟叶的色泽、油分、弹性和香吃味等，以提高茄衣的可用性[1]。但雪茄烟的发酵技术作为企业的“秘方”基本都不对外公开，因此，国内外有关这方面的公开研究报道十分少见[2～4]。

国内外的研究表明[5～7]，在烟叶醇化过程中加入微生物可以缩短醇化的时间， 具有减轻刺激、消除青杂气和提高香气质的作用。 尤其是利用微生物以及酶制剂等的发酵技术，对烟叶品质改善、 烟草薄片及烟梗的品质和亚硝胺等有害物质降解的研究，日益受到烟草工业企业的广泛重视。

本研究选用我国海南光村种植的雪茄茄衣品种为实验材料，通过在恒温恒湿箱中进行人工发酵，鉴定出茄衣表面微生物，探索了通过人工添加优势微生物以提高雪茄茄衣发酵进程和质量的方法，为微生物及酶制剂作用于雪茄发酵提供指导，以期为优质雪茄茄衣生产提供依据。

1材料与方法

1.1试验材料与仪器

海南建恒哈瓦那雪茄有限公司产“建恒二号”雪茄茄衣烟叶(二级);LRH-150-SⅡ智能型恒温恒湿箱。

1.2试验条件及取样方法

将雪茄茄衣平摊分堆摞放，置于恒温恒湿箱中，在温度40℃和相对湿度70%条件下发酵42 d[1]。每6 d取样一次，并对雪茄茄衣叶面微生物进行分离、鉴定,并观察优势菌种菌落形态特征，进行生理实验。

2结果与分析

2.1发酵过程中茄衣表面微生物数量的变化

在本实验设置发酵条件下，对茄衣表面微生物进行平板分离实验，得出了不同种类微生物的数量(表1)。由表1可见，整个发酵过程中没有分离到酵母菌和放线菌，同时可以看出在整个发酵过程中，细菌的数量占到微生物总量的99% 以上，而霉菌只占很小一部分。微生物的数量随着发酵的进行，呈现出大幅度的下降，最终达到起始数量的10%以下。

2.2发酵过程中茄衣叶面微生物种群的变化

对茄衣表面占优势的细菌进行分类鉴定，结果见表2和表3。根据革兰氏染色情况、芽孢观察以及生理生化实验，不同菌种的显微照相形态特征、菌落特征见图1、图2。1～8号菌株分别为：蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌。8株菌的数量从大到小依次为：巨大芽孢杆菌>枯草芽孢杆菌>蜡状芽孢杆菌>环状芽孢杆菌>蕈状芽孢杆菌>嗜热脂肪芽孢杆菌>短小芽孢杆菌>凝结芽孢杆菌。

表1　发酵过程中微生物数量的变化

表2　微生物优势菌种菌落形态和特征

表3　微生物优势菌种部分生理试验

注：“+”：正常生长；“-”：不能生长。

由上述结果可看出，在雪茄茄衣人工发酵过程中，芽孢杆菌为优势菌种。酵母菌等菌种很可能由于其不耐热特性，在调制过程中大量脱水死亡。

由图3(彩图见图版二)可看出，所有的菌中，巨大芽孢杆菌占芽孢杆菌的50%以上，为优势菌种，其次是枯草芽孢杆菌，占19%左右，因此巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌这两个菌种是雪茄茄衣发酵过程中的优势菌种。由图3可见，随着发酵的进行，在发酵前24 d，各种微生物数量呈现出急剧下降的趋势，到24 d之后，大部分微生物数量降为零，少数为痕量。

图1　不同菌种显微照相形态特征Fig.1　Microbial micrography morphological characteristics of different species bacteria.

图2　不同菌种菌落形态特征Fig.2　Microbial colony morphology of different species bacteria.

图3　不同细菌种数量的变化趋势Fig.3　Amount changes of different species bacteria.(彩图见图版二)

3讨论

目前国内外对烤烟叶表面微生物在烟叶陈化和发酵中的作用做了大量研究[8～13]，但在雪茄烟上国内未见相关文献，国外也鲜有报道[14,15]。有人认为烟叶是在微生物的作用下开始发酵的，随后才进行无机化学反应[3]。雪茄微生物在雪茄发酵过程中处于十分活跃状态，并能提高雪茄发酵的强度和质量[16]。

本文在40℃、湿度70%的条件下对海南茄衣进行连续42 d人工发酵观察，并对整个发酵过程中茄衣叶面微生物进行了鉴定，可以看出以细菌中的芽孢杆菌为主的微生物数量一直呈现下降趋势，直到下降为痕量。

通过革兰氏染色、芽孢观察和生理实验，对分离出的菌种鉴定及数量大小为：巨大芽孢杆菌>枯草芽孢杆菌>蜡状芽孢杆菌>环状芽孢杆菌>蕈状芽孢杆菌>嗜热脂肪芽孢杆菌>短小芽孢杆菌>凝结芽孢杆菌。后期可以依据生产的验证情况对菌种进行16S序列验证比对。

工业生产中经常在烤烟发酵时通过加入微生物或酶制剂等提高发酵速率，提高烟叶品质[11,17～19]。因此可以在本实验条件下，加入巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等菌种促进雪茄茄衣的发酵，提高发酵质量、缩短发酵时间。但是，雪茄发酵湿度、温度和时间均不同于烤烟，对于微生物在雪茄发酵中的添加研究还仅限于在实验室人工控制的少量样本条件下进行，本实验对随后的生产发酵提供了一个方向，后期实验应配合实际发酵过程、规模和对应的评吸，以期达到预期的效果，使生物技术更好的服务于生产。

参考文献

[1]金敖熙.雪茄烟生产技术[M].北京：轻工业出版社,1982.

[2]杨振义.晾晒烟叶人工发酵研究[J].西北烟草，1991,(1)：36-38.

[3]张敬祥.低次烤烟和晾晒烟陈化实验报告[J].烟草科技，1986,(1)：22.

[4]张水佑，胡宗庆，曹鲜会，等.混合型卷烟生产工艺问题的探讨[J].烟草科技，1988,(4)：19-21.

[5]Tamayo A I, Cancho F G. Microbiology of the ferm entation of Spanish tobaccos[J]. Int. Congress Microbiol., 1953,6:48-50.

[6]English C F, Bell E J, Berter A J. Isolation of therm opiles from road leaf tobacco and effect of pure culture inoculation on cigar aroma and mildness[J]. Appl. Microbio., 1967, 15:117-119.

[7]马 林.利用生物技术改变烟叶化学组分提高其吸食品质和安全性的研究[J].郑州工程学院学报,2001,22(3):40-42.

[8]陈福星，王 磊，莫湘涛，等.烟叶微生物发酵的探讨[J].微生物学通讯，1990,(2)：37-39.

[9]Tamayo A I, Cancho F G. Microbiology of the fermentation of Spanish tobacco [C]. Int. Congress Microbiol., 1953，48-50.

[10]韩锦峰，朱大恒，刘卫群.陈化发酵期间烤烟叶面微生物活性及其应用研究[J].中国烟草科学，1997，(4)：13-14.

[11]谢 和，韩忠礼，赵维娜.微生物发酵对烤烟内在品质的影响[J].山地农业生物报，1999,(4)：227-230.

[12]English C F,Bell E J,Berger A J. Isolation of thermophiles from broadleaf tobacco and effect of pure culture inoculation on cigar aroma and mildness [J].App1.Microbe, 1967，(15)：117-119.

[13]邱立友，赵铭钦，岳雪梅，等.自然发酵烤烟叶面微生物区系的分离鉴定[J].烟草科技，2000，(3)：14-17.

[14]Reid J J，Mckinstry D W，Haley E E.Studies on the fermentation of tobacco 1.The microflora of cured and fermenting cigar-leaf tobacco [J].Pennsylvania Agric. Exp. Station Bull.，1933, (356)：1-17.

[15]Koller J B C. Der tabak in naturwissenschaf-tlicher [A]. In: Landwirt Schaftlicher Technischer Beziehung [M]. Aurgsbury, 1858.

[16]朱越雄，曹广力，郁金芳.桑园土壤芽孢杆菌分析[J].江苏蚕业，2001,(4)：5-7.

[17]吕向阳，蒋如璋，王桂芬.巨大芽孢杆菌淀粉酶基因的克隆及其在枯草杆菌中的表达[J].遗传学报，1991，18(2)：185-192.

[18]罗家基，朱子高，罗 毅，等.微生物在烟叶发酵过程中的作用[J].烟草科技，1998, (1)：6.

[19]赵铭钦，邱立友，刘伟城，等.烤烟发酵增香菌株的鉴定和初步应用研究[J].黑龙江烟草，1999，13(3)：17-20.

Studies on Leaf Surface Microflora of Cigar-wrapper During Artificial Fermentation

DU Jia1, ZHANG Xiao-juan1, WU Gang2, ZHOU Rui-sheng3, CUI Yu-hui4, SHI Xiang-dong1*

1.TobaccoCollege,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China;2.TheSichuanChongqingTobaccoIndustryLimitedLiabilityCompany,Chengdu610017,China;3.HainanJianhengHavanaCigarCo.,HainanDanzhou571700,China;4.ChinaNationalTobaccoCorpHainanBranch,Haikou570011,China

Abstract:The cigar-wrapper was fermented for 42 days in Humidity Chamber, and the tobacco leaf surface microbe was separated, purified and identified. The study discussed the changes of cigar-wrapper artificial fermentation process of microbial flora. The results showed that: In cigar-wrapper artificial fermentation process, bacterial was the dominant flora, and mold accounted for a small proportion, and actinomycetes and yeasts were not found; All the bacterials were bacteria Bacillus, the number descending order were as follows: Bacillus megaterium> Bacillus subtilis> Bacillus cereus> Bacillus circulans> Bacillus mycoides> Bacillus stearothermophilus>Bacillus pumilus>Bacillus coagulans; The number of bacteria in the cigar-wrapper surface fermentation process showed a sharp downward trend in the first 24 d; Bacillus megaterium and Bacillus subtilis were the dominant species of cigar-wrapper artificial fermentation. Bacillus megaterium accounted for more than 50% and Bacillus subtilis accounted for about 19%.

Key words:cigar-wrapper tobacco; artificial fermentation; leaf surface; microflora

收稿日期：2016-02-21; 接受日期：2016-04-04

基金项目：中国烟草总公司项目(110201202013);四川烟草工业有限责任公司项目(川渝烟工技研(2009)368号)资助。

作者简介：杜佳，硕士研究生，研究方向为烟草栽培生理。E-mail：dujia5613@163.com。*通信作者：时向东，教授，博士，硕士生导师，主要从事烟草栽培生理生化研究。Tel：0371-63558589；E-mail：yancaoshixd@163.com

DOI:10.3969/j.issn.2095-2341.2016.03.07