青蒿内生真菌研究进展

李玲玲

重庆工贸职业技术学院, 生物化学工程系, 重庆 408000



青蒿内生真菌研究进展

李玲玲

重庆工贸职业技术学院, 生物化学工程系, 重庆 408000

摘要：植物内生真菌可以产生与宿主植物相同或相似的次生代谢产物，已成为活性化合物生产和发现新化合物的重要来源。为了解青蒿内生真菌的潜在应用价值，介绍了青蒿内生真菌的生物多样性、生物活性和部分次生代谢产物，并展望了未来的研究方向，以期为进一步开发利用青蒿内生真菌提供参考。

关键词：青蒿；内生真菌；次级代谢产物

青蒿是菊科植物黄花蒿的全草，具有抗疟、抗菌、抗肿瘤、抗寄生虫和免疫调节等作用。青蒿素作为其中的有效成分，其结构为含有过氧桥的倍半萜内酯类化合物。青蒿素对脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点，已成为世界卫生组织推荐的抗疟疾药品[1]。

药用青蒿素的生产目前主要是通过有机溶剂从中药黄花蒿的叶和花蕾中提取，但从中药中提取的药物，其品质受到采集地和采集期的影响，所以需要寻找新的生产青蒿素的方法。目前青蒿素的化学合成已经取得了一定进展[2]。另一条可行的方法是通过青蒿内生真菌生产青蒿素。近年来，越来越多的研究证明内生真菌可产生与宿主植物相同或相似的次级代谢产物，从而使其成为活性化合物生产和发现新化合物的有效途径。通过青蒿内生真菌来生产青蒿素，就可以避免采集地和采集期不同对青蒿素品质的影响，有利于青蒿素生产和品质的稳定。

1青蒿内生真菌多样性

内生真菌在植物中普遍存在，具有分布广、种类多的特点，但分离出的内生真菌的种类和数量受多种因素的影响。对青蒿不同部位严格表面消毒后，利用组织分离法、研磨法等分离内生真菌，发现不同地区和不同部位分离到的内生真菌存在一定的差异。从浙江临安天目山黄花蒿的根、茎和叶中共分离到内生真菌37株，初步鉴定属于囊孢菌(Capsule)、头孢霉(Cephalosporium)、弯孢霉(Curvularia)、曲霉(Aspergillus)和毛霉(Mucor)，囊孢菌属于优势种[3]。而从湖南农业大学实验田黄花蒿的茎和叶中分离到的内生真菌则分别属于：束梗孢属(Stilbellales)、丝孢霉属(Hyphomycetales)、侧孢霉属(Sporotrichum)、丝核菌属(RhizoctoniasolaniKuhn)、曲霉属(Aspergillus)、拟青霉属(Paecilemyces)、链格孢属(AlternariaNees)、青霉属(Penicillium)和毛霉属等[4]。可见因产地和分离部位不同，青蒿内生真菌有很大的差异性，优势种群也有较大的差异。

2青蒿内生真菌生物活性

2.1抗菌

青蒿活性成分中的挥发油和青蒿素具有抗菌作用[5,6]。通过对青蒿内生真菌抗菌活性进行研究，发现青蒿内生真菌对植物病原真菌具有一定的抗菌活性。田晓曼等[7]从青蒿植株中共分离到内生真菌12株，其中5株内生真菌对8种植物病原真菌表现出了不同程度的拮抗，拮抗作用强的有3株。因此可以利用青蒿内生真菌能够调节植物抗病虫害的特性，进行生物防治。青蒿内生真菌也具有一定的抗人类病原微生物的能力。魏宝阳等[4]从黄花蒿茎中分离到13株内生真菌，其中12株内生真菌的次生代谢产物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和大肠杆菌(Escherichiacoli)有不同程度的抑菌活性，活性成分多集中于乙酸乙酯相。Zhang等[8]从黄花蒿中分离到11株内生真菌，有3株内生曲霉菌对3种人类病原微生物——大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)显示出了较强的抗性。

2.2抗肿瘤和抗氧化活性

自Stierle[9]从太平洋红豆杉树皮的内生真菌发酵液中分离到具有抗癌作用的紫杉醇后，研究内生真菌的抗肿瘤活性已成为了内生真菌的一个研究热点。已有研究发现，青蒿内生真菌也具有抗肿瘤活性，钱一鑫等[10]测定了68株青蒿内生真菌的抗肿瘤和抗氧化活性，发现有8株内生真菌至少对3种癌细胞：HL-60(人白血病细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)和COLO205(人结肠癌细胞)中的一种有细胞毒性，其中一株对3种肿瘤细胞生长均有抑制作用；5株具有不同程度的清除DPPH自由基的活性。其中1株内生真菌同时具有细胞毒活性和抗氧化活性，形态学鉴定属于拟茎点霉属。曾茜等[11]从黄花蒿的内生青霉中分离的代谢产物 A 疑似为青蒿素类化合物，对人前列腺癌细胞PC3和人非小细胞肺癌细胞A549具有中等细胞毒活力。这也为寻找天然抗肿瘤和抗氧化活性物质提供了一条新途径。

2.3促生长及青蒿素合成

青蒿内生真菌可促进宿主植物生长及细胞合成青蒿素。黄花蒿内生真菌优势种青霉菌的培养液及菌丝匀浆后采用高压灭菌、培养液高压灭菌和培养液过滤除菌3种方法制备成的诱导子A、B和C，放入黄花蒿组培苗培养基中，培养一段时间，发现3种诱导子对植株生长及青蒿素合成都有促进作用，效果最好的诱导子C可促进黄花蒿组培苗的干重增加44.44%，青蒿素产量提高了58.86%。同时发现内生真菌细胞壁中的多糖成分也可提高黄花蒿植物细胞中青霉素的产量[12]。内生胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)细胞壁中的糖类诱导物可以使黄花蒿发根培养系统中的青霉素产量提高51.63%，其诱导作用与诱导子浓度和作用时间相关[13]。可见，青蒿内生真菌的多种成分对宿主植物生长及青蒿素合成有促进作用，原因可能是其影响了宿主植物的代谢途径或酶活性，也可能是产生了促进植物生长的激素。

3青蒿内生真菌代谢产物

目前对青蒿内生真菌代谢产物研究较多的是南京大学的谭仁祥教授课题组，他们从青蒿内生真菌不同属的菌株中分离到了一些活性代谢产物，部分属于首次发现的新化合物。

3.1麦角甾类化合物

麦角甾类化合物在内生真菌中具有种类多、含量大的特点，且具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化和抑菌等作用[14]。Lu等[15]从青蒿内生真菌中分离到比较多的代谢产物是麦角甾类化合物，他们从内生炭疽菌(Colletotrichumsp.)中分离到了7种不同的化合物，分别是麦角固醇(ergosterol)、3β,5α,6β-三羟基麦角甾-7,22-二烯(3β,5α,6β-trihydroxyergosta-7,22-diene)、3β-羟基麦角甾-5-烯(3β-hydroxy-ergosta-5-ene)、3-氧代麦角甾-4,6,8(14),22-四烯(3-oxo-ergosta-4,6,8(14),22-tetraene)、3β-羟基-5α,8α-过氧化麦角甾-6,22-二烯(3β-hydroxy-5α,8α-epidioxy-ergosta-6,22-dien)、3β-羟基-5α，8α-过氧化麦角甾-6,9(11),22-三烯(3β-hydroxy-5α,8α-epidioxy-ergosta-6,9(11),22-triene)和3-氧代麦角甾-4-烯(3-oxo-ergosta-4-ene)。

3.2植物激素、维生素及其他代谢产物

青蒿内生真菌长期和宿主植物生活在一起，对青蒿的生长发育起到了很重要的作用，可以产生促进青蒿生长的植物激素。2000年Lu等[14]从内生炭疽菌中除分离到比较多的麦角甾类化合物外，还分离到了植物激素吲哚乙酸 (IAA)。青蒿内生真菌还可以产生维生素等代谢产物。2009年Shen等[16]从黄花蒿内生菌露湿漆斑菌(Myrotheciumroridum)IFB-E012发酵液中分离到了烟酸，同时还从露湿漆斑菌中还分离到了7，8-二甲基异咯嗪、胡萝卜苷、对羟基苯甲酸和尿嘧啶等物质。

3.3新型代谢产物

研究者们从内生炭疽菌(Colletotrichumspp.)中分离到了3种新的抗菌代谢产物： 6-异戊烯吲哚-3-羧酸(6-isoprenylindole-3-carboxylic acid)、3β，5α-二羟基-6β-乙酰麦角甾-7，22-二烯(3β,5α-dihydroxy-6β-acetoxy-ergosta-7,22-diene)、3β，5α-二羟基-6β-苯乙酰氧麦角甾-7，22-二烯(3β,5α-dihydroxy-6β-phenylacetyloxy-ergosta-7,22-diene)[15]。2002年Liu等[17]从内生小球腔菌属(Leptosphaeria)中分离到了一个带有新颖碳骨架的代谢产物Leptosphaerone。2006年Ge等[17]从内生真菌Paraphaeosphaerianolinae中分离到了一种新化合物Paranolin。

4展望

青蒿的化学成分可分为挥发性和非挥发性两大类，挥发性成分多为挥发油，主要成分有蒿酮、异蒿酮、茨烯、丁香烯、左旋樟脑、月桂烯、樟脑等。非挥发性成分主要有青蒿素、青蒿甲素、青蒿丙素以及青蒿素的多种衍生物[19]。目前青蒿的许多化学成分还未从青蒿内生真菌中分离出来，特别是最具药用价值的青蒿素。可见，青蒿内生真菌的开发潜力很大，可作为生产活性代谢产物的一种可持续利用资源。今后应加大青蒿内生真菌筛选和鉴定的力度，采用色谱、质谱等先进的分离技术和化合物结构鉴定技术，更加深入研究内生真菌的次级代谢产物及其生物活性，以期开发出具有青蒿类似活性或活性更强的药物，对于能够产生青蒿类似活性的内生真菌，应当对其产活性物质的稳定性、发酵培养条件以及菌种选育技术等进行深入研究，使内生真菌发酵生产药物向工业化迈进。

参考文献

[1]徐 溢,范 琪,盛 静,等.青蒿素的提取分离和检测方法研究进展[J].药物分析杂志,2013,3(9):1465-1470.

[2]付彦辉,钟 俊,罗素琴,等.青蒿素的化学合成研究进展[J].中国药学杂志,2014,49 (10):795-805.

[3]刘金花,吴玲芳,章华伟.黄花蒿内生菌的分离与初步鉴定[J].氨基酸和生物资源,2011,33(4)：27-30.

[4]魏宝阳,黄红英,李顺祥,等.黄花蒿内生真菌的抑菌活性筛选[J].湖南农业科学,2008, 4:100-101,103.

[5]张丽勇.青蒿挥发油的提取及抗菌活性研究[D].长春：东北师范大学,硕士学位论文, 2011.

[6]文 学.青蒿素抗菌作用研究[J].人参研究,2009,4: 38-39.

[7]田小曼,吴云锋,张 珏.青蒿内生菌的分离及抗病活性物质的筛选[J].西北农业学报,2008,17(4):186-190.

[8]Zhang H W, Bai X L, Wu B X. Evaluation of antimicrobial activities of extracts of endophytic fungi fromArtemisiaannua[J]. Bangladesh J. Pharmacol., 2012,7(2):120-123.

[9]Stierle A, Strobel G, Stierle D. Taxol and taxane production byTaxomycesandreanae, an endophytic fungus of pacific yew[J]. Science,1993,260(5105):214-216.

[10]钱一鑫,康冀川,耿 坤,等.青蒿内生真菌的抗肿瘤抗氧化活性[J].菌物研究,2014,12(1):44-50.

[11]曾 茜,雷帮星,康冀川,等.蒿属植物内生真菌Penicilliumsp.抗癌活性产物的液体发酵工艺优化[J].山地农业生物学报,2014, 3(3):17-24.

[12]袁亚菲,董 婷,王剑文.内生青霉菌对黄花蒿组培苗生长和青蒿素合成的影响[J].氨基酸和生物资源,2011,33(4):1-4.

[13]王剑文,郑丽屏,谭仁祥.促进黄花蒿发根青蒿素合成的内生真菌诱导子的制备[J].生物工程学报,2006, 22(5):829-834.

[14]宋明杰,包海鹰.菌物中麦角甾类化合物的研究进展[J].菌物研究,2014,11(4):266-273.

[15]Lu H, Zou W X, Hu J,etal.. New bioactive metabolites produced byColletotrichumsp., an endophytic fungus inArtemisiaannua[J]. Plant Sci., 2000, 151(1)：67-73.

[16]Shen L, Shi D H, Song Y C,etal.. Chemical constituents of liquid culture of endophyte IFB-E012 inAreimisiaannua[J]. Chin. J. Nat. Med., 2009,7(5):354-356.

[17]Liu J Y, Liu C H, Zou W X,etal.. Leptosphaerone, a metabolite with a novel carbon skeleton fromLeptosphaeriasp. IV403, an endophytic fungus inArtemisiaannua[J]. Helvet. Chim. Acta, 2002, 85(9):2664-2667.

[18]Ge H M, Song Y C, Chen J R,etal.. Paranolin: a new xanthene-based metabolite fromParaphaeosphaerianolinae[J]. Helvet. Chim. Acta, 2006, 89(3):502-506.

[19]谢英辉. 青蒿挥发油抗菌活性研究[D]. 长春:东北师范大学,硕士学位论文,2007.

Advances of Endophytic Fungi fromArtemisiaannus

LI Ling-ling

BiochemistryEngineeringDepartment,ChongqingIndustry&TradePolytechnic,Chongqing408000,China

Abstract:Plant endophytic fungi can produce secondary metabolites which are similar to the host plants. It has become an important production source of active compounds and discovery way of new compounds. In order to explore the potential application value of endophytic fungi from Artemisia annus, recent advances on the biodiversity, bioactive and metabolites of endophytic fungi from Artemisia annus were summarized. Some recommendations for future research of endophytic fungi from Artemisia annus were put forward, which was expected to provide references for the resource exploitations of endophytic fungi from Artemisia annus.

Key words:Artemisia annus; endophytic fungi; metabolites

收稿日期：2015-11-24; 接受日期：2015-12-21

基金项目：重庆工贸职业技术学院自然科学项目(ZR201310)资助。

作者简介：李玲玲，讲师，研究方向为微生物制药。E-mail:729005755@qq.com

DOI:10.3969/j.issn.2095-2341.2016.03.06