2-甲氧基雌二醇对小鼠恶性黑色素瘤B16细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响

胡彩霞，冯 佳，吕丽景，高顺强，王文氢 ，张国强*

(1.河北医科大学第四医院皮肤科, 河北 石家庄 050011;2.中国人民解放军白求恩国际和平医院消化内科，河北 石家庄 050082)



·论 著·

2-甲氧基雌二醇对小鼠恶性黑色素瘤B16细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响

胡彩霞1，冯 佳2，吕丽景1，高顺强1，王文氢1，张国强1*

(1.河北医科大学第四医院皮肤科, 河北 石家庄 050011;2.中国人民解放军白求恩国际和平医院消化内科，河北 石家庄 050082)

目的探讨2-甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol，2-ME)对恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM) B16细胞增殖、侵袭及迁移的影响。方法将体外培养的小鼠MM B16细胞用不同浓度(10、20、40 μmol/L)的2-ME处理。未经任何处理的小鼠MM B16 细胞，记作B16-negative。倒置显微镜下观察细胞形态，平板克隆形成实验检测2-ME处理小鼠MM B16细胞2周后的克隆形成能力。Transwell方法观察药物在体外对细胞趋化侵袭能力的影响。观察药物在体外对细胞迁移能力的影响。细胞划痕实验观察经10 μmol/L 2-ME处理MM B16细胞24 h后划痕愈合程度。结果与对照组比较，不同浓度的2-ME处理MM B16细胞后克隆形成率差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，2-ME组细胞侵袭能力及迁移能力差异均有统计学意义(P<0.05)。划痕实验证实对照组的MM B16细胞经过24 h后几乎迁移至所有的划痕区域，而实验组MM B16-10 μmol/L的划痕区域仅有部分由MM B16 细胞占有。结论 2-ME对小鼠MM B16细胞的增殖具有抑制作用，能够抑制MM B16细胞的克隆形成能力。2-ME可以抑制小鼠MM B16细胞的侵袭和迁移运动能力。

黑色素瘤；雌二醇；肿瘤浸润；小鼠

恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)是由神经鞘细胞恶变异常增殖形成的。其源自于调控重要细胞功能基因的激活与失活，包括调控细胞周期、生存、血管生成、细胞迁移及扩散等[1]。有研究表明，黑素瘤自发凋亡水平较低，可能是导致其发展迅速、容易转移的众多因素之一[2]。这也使得深入研究黑素瘤发生侵袭迁移的机制、探索新药物及新的治疗方案显得尤为重要。2-甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol，2-ME)为内源性17β-雌二醇的体内代谢产物，众多研究者发现2-ME可以抑制多种肿瘤细胞的活性，包括神经胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、宫颈癌、卵巢癌以及造血系统肿瘤等[3]。本研究旨在探讨在体外2-ME对小鼠MM B16细胞的增殖、侵袭以及迁移能力的影响，报告如下。

1 资料与方法

1.1 实验材料 小鼠MM B16细胞由河北医科大学第四医院科研中心惠赠。2-ME购自美国Cayman公司，RPMI-1640培养基购自美国GIBCOL公司，四甲基偶氮唑蓝购自上海永叶生物科技有限公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司，Transwell小室(直径8 μm)购自美国Costar公司。

1.2 细胞培养 MM B16细胞使用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基(含浓度为10×104U/L青霉素、10×104μg/L链霉素，pH 7.3)于5%CO2、37 ℃饱和湿度培养箱常规培养。倒置显微镜下观察细胞形态。

1.3 实验方法

1.3.1 分组设计 取对数生长期的小鼠MM B16细胞随机分组。实验组：用不同浓度的2-ME处理小鼠MM B16细胞，使其终浓度分别为10 、20 、40 μmol/L，分别记作B16-10 μmol/L、B16-20μmol/L、B16-40μmol/L。阴性对照组：未经任何处理的小鼠MM B16 细胞，记作B16-negative。

1.3.2 平板克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力 取出对数生长期的细胞，完成细胞重悬液的制备。计数细胞，将细胞浓度稀释为5×106/L。 将稀释好的细胞悬液分别接种入无菌细胞培养皿内，每皿100 μL细胞悬液，当细胞完全贴壁时，进行随机分组，将已配置好的含各个药物浓度的培养基加入培养皿中，对照组加入等体积的培养基，培养 2周，待细胞长出肉眼可见的细胞克隆时即中止培养。进行细胞染色并细胞克隆计数：细胞克隆形成率按下公式计算，克隆形成率 = 克隆形成数/接种细胞数(500)×100%。

1.3.3 Transwell法检测细胞的侵袭情况 将Matrigel 胶融化，按体积比为1∶8与RPMI-1640培养基混合，以每孔 50 μL 加入到小室的上室面，将小室放入24孔板内，置于37 ℃孵箱内 6 h，使胶凝固。每组细胞制备4个小室，共制备16个小室。用无血清RPMI-1640培养基将细胞稀释成1×109/L的细胞悬液。水化基质膜后，对照组加入10 μL的培养基，实验组分别加入10 μL的浓度为10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的2-ME，每组复3孔，并做好标记，将 24 孔板放入孵箱内继续培养24 h。进行细胞染色，显微镜下细胞计数。

1.3.4 Transwell法检测细胞的迁移情况 实验步骤基本同上述的Transwell 细胞侵袭实验，区别为：①无需包被Matrigel胶，在小室内直接接种细胞；②稀释细胞时将细胞悬液稀释至5×108/L，每孔加入 200 μL细胞悬液，即每孔接种细胞数为1×105个；③下室面加含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基；④培养 8 h 后进行细胞Giemsa染色，在显微镜下每膜计数5个视野进行计数，计算平均值。

1.3.5 细胞划痕实验 选取处于对数生长期的MM B16细胞，制备细胞悬液，接种细胞于 12孔细胞培养板中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养 24 h。人工划痕：在细胞密集处用移液器枪头做一字划痕，造成培养细胞切口模型，置于显微镜下观察，记录划痕宽度。按实验设计进行随机分组，实验组加入含10 μmol/L 2-ME的培养液常规培养，对照组只加入等体积的培养液。于24 h后倒置显微镜下观察划痕愈合情况，记录 0 h及 24 h细胞向划痕方向的移动情况并拍照记录。

2 结 果

2.1 倒置显微镜下观察细胞形态 经2-ME处理48h后，实验组(B16-10μmol/L、B16-20μmol/L、B16-40μmol/L)细胞贴壁能力均呈现下降趋势，可见漂浮状细胞，部分细胞变圆，B16-negative组部分细胞聚集成片状，贴壁生长良好，数量增多，大部分呈多角形，可见伪足，细胞浆液均匀饱满，具有良好的折光性(图1)。

图1 不同浓度的2-ME作用48 h后对小鼠MM B16细胞的形态学影响(×200)

A.阴性对照组细胞形态；B.10 μmol/L 2-ME组细胞形态；C.20 μmol/L 2-ME组细胞形态；D.40 μmol/L 2-ME组细胞形态

Figure 1 Cellular morphology analysis of MM B16 melanoma cells treated with 2-ME at different concentrations for 48 hours( ×200)

2.2 各组细胞克隆、侵袭力和穿模细胞数比较 应用平板克隆形成实验，以不同浓度(10、20、40 μmol/L)的2-ME干预MM B16 2周，观察各组细胞克隆形成数，结果显示随着2-ME浓度的升高，各组克隆形成率逐渐降低(图2)； 应用Transwell 法检测细胞侵袭能力，经不同浓度(10、20、40 μmol/L)的2-ME干预24 h后，于显微镜下观察可见实验组细胞数目均少于对照组；应用Transwell 法检测细胞迁移能力，结果显示不同浓度(10、20、40 μmol/L)的2-ME干预8 h后，于显微镜下观察可见实验组细胞数目均少于对照组。 各组克隆形成率、穿Matrigel胶细胞数和穿膜细胞数比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组克隆形成率、穿Matrigel胶细胞数和穿膜细胞数比较

Table 1 The cloning efficiency,the numbers of invasive melanoma cells and migratory melanoma cells in different groups

组别 克隆形成率(%)穿Matrigel胶细胞数(个)穿膜细胞数(个)对照组 60.6±3.175.0±5.689.8±5.1B16-10μmol/L32.5±1.8*51.0±4.3*72.6±5.6*B16-20μmol/L19.0±2.3*#38.8±4.2*#54.4±9.2*#B16-40μmol/L13.5±1.9*#△20.2±4.8*#△32.8±6.0*#△F 238.794115.48067.227P 0.0000.0000.000

*P<0.05与对照组比较 #P<0.05与B16-10 μmol/L组比较 △P<0.05与B16-20 μmol/L组比较(q检验)

图2 2-ME作用不同浓度的MM B16细胞2周后对其克隆能力的影响

A.阴性对照组；B.10 μmol/L 2-ME组；C.20 μmol/L 2-ME组；D.40 μmol/L 2-ME组

Figure 2 Effects of 2-ME on the colony capacity of MM B16 melanoma cells treated with 2-ME at different concentrations for 2 weeks

2.3 细胞划痕实验结果 划痕实验证实阴性对照组的MM B16细胞经过24 h后几乎迁移至所有的划痕区域，而10 μmol/L实验组的划痕区域仅有部分由MM B16 细胞占有(图3)。

图3 10 μmol/L 2-ME作用MM B16细胞24 h后对其迁移能力的影响

A.对照组0 h；B.对照组24 h；C.实验组0 h；D.实验组24 h

Figure 3 Effects of 2-ME on the migration capacity of MM B16 melanoma cells treated with 2-ME at 10 μmol/L

3 讨 论

恶性肿瘤发生、发展、形成是多种因素共同作用的结果，造成调节和控制细胞生长、增殖的功能发生严重紊乱，从而导致细胞无限制增长，目前各种调控细胞功能的癌基因和抑癌基因与恶性肿瘤发生发展的关系越来越受到人们的关注[4]。恶性肿瘤特殊表现除肿瘤细胞的无限制生长以外，还包括其对周围正常组织的直接侵袭，以及通过血液，淋巴液等向远处组织的转移。因此，抑制肿瘤细胞无限制的增殖、侵袭和转移是治疗肿瘤的有效方法。MM恶性度高，生长较快，极易在疾病早期发生转移，其预后极差，病死率较高。近几十年中，MM的发病率呈逐渐增加趋势，美国国家癌症研究所估计2015年美国大约有73 870例新发的MM病例(其中女性42 670例，男性31 200例)[5]。目前治疗MM的主要方法仍然是外科手术切除，但有研究指出术后仍可在局部或远处发生复发和转移[6]。现今达卡巴嗪成为治疗转移性MM主要药物[7]，但MM对放化疗的不敏感性使其预后更差。有研究表明，目前常用的治疗MM药物(如顺铂、紫杉醇、卡铂、替莫唑胺、达卡巴嗪等)无法进一步提高患者的生存率，且药物治疗会对人体产生严重的不良反应[8-9]。目前尚无特效抗MM药物，因此寻求新型的抗MM药物是必然趋势。

2-ME是内源性雌激素代谢物，具有多种抗肿瘤活性作用。目前，已将2-ME单独或联合其他化疗药物如硼替佐米、索拉非尼用于多发性骨髓瘤、肝细胞癌等多种肿瘤细胞株的实验研究[10-11]。其具体作用机制包括抑制多种肿瘤滋养血管的生成、延缓肿瘤细胞复制周期，甚至造成肿瘤细胞复制停滞以及诱导肿瘤细胞凋亡等，而这些作用并不是通过与雌激素受体结合产生的[12]，故2-ME并不会产生雌激素的不良反应，安全性相对较高。本研究从基础实验来探讨2-ME对小鼠MM B16细胞的增殖、侵袭和转移的影响，旨在为2-ME用于临床治疗MM提供基础理论依据。

MM细胞的无限增殖是其特点之一，平板克隆形成实验是检测单个细胞增殖能力的较为常见的实验。本研究结果显示，在3个实验组中给药浓度越高其集落形成越少，对照组、B16-10 μmol/L组、B16-20 μmol/L组和B16-40 μmol/L组克隆形成率分别为(60.6±3.1)%、(32.5±1.8)%、(19.0±2.3)%、(13.5±1.9)%。表明随着给药浓度的增加，2-ME抑制小鼠MM B16细胞克隆能力越明显，可见2-ME对MM B16细胞的增殖具有抑制作用，其结果与前期实验中SRB法检测2-ME对小鼠MM B16细胞的增殖具有抑制作用的结果相一致[13]，两者结合更进一步证实了2-ME对小鼠MM B16细胞的增殖具有抑制作用。

侵袭和转移是恶性肿瘤的标志，是其致死的主因。肿瘤的侵袭转移是一个连续、渐进的多步骤动态过程，包括黏附、运动、增殖、基质降解以及新生血管形成等多步骤信号级联反应[14]。本研究中的Transwell侵袭实验是观察小鼠MM B16细胞在趋化剂诱导下穿过多孔滤膜的情况，它是测定细胞侵袭能力的经典模型，已被广泛应用于探讨癌细胞侵袭的相关研究中。结果可以看出10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的2-ME均能抑制小鼠MM B16细胞的侵袭能力，且随着浓度的增加，抑制侵袭能力的作用越显著。同样，通过Transwell迁移实验可以看出2-ME能够抑制鼠黑色素瘤B16细胞的迁移运动能力，随着各组之间药物浓度的增加，抑制此肿瘤的迁移能力的作用也越来越显著。细胞划痕实验是模拟体内伤痕康复模型，可观察细胞迁移的情况，是测定细胞迁移能力的经典方法。本研究结果显示2-ME可以抑制小鼠MM B16细胞的迁移能力，与经Transwell迁移实验所得结果相一致。细胞划痕实验与Transwell迁移实验共同证实2-ME可以抑制MM B16细胞的迁移运动能力。

总之，MM是恶性度极高的肿瘤，极易发生侵袭与转移。其发生、发展、形成是多种因素参与作用的共同结果。从目前治疗现状来看，治疗MM的关键是早发现早治疗。对2-ME作用于MM的研究并不多见，通过平板克隆实验提示2-ME可能对MM增殖产生抑制作用，通过Transwell 侵袭迁移实验和细胞划痕实验研究发现2-ME可以抑制肿瘤的侵袭和迁移，但这只是体外实验的一部分，其详细作用机制需进行相关基因的体内外实验进一步探讨。

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Effects of 2-Methoxyestradiol on growth, invasion and migration of malignant melanoma B16cells

HU Cai-xia1, FENG Jia2, LV Li-jing1, GAO Shun-qiang1,WANG Wen-qing1, ZHANG Guo-qiang1*

(1.Department of Dermatology, the Forth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China；2.Department of Gastroenterology, the Bethune International Peace Hospital, Shijiazhuang 050082, China)

Objective To observe the effects of 2-methoxyestradiol(2-ME ) on proliferation, invasion, migration of malignant melanoma(MM) B16 cells. Methods MM B16 cells cultured in vitro were regarded as the control group. MM B16 cells were treated with different concentrations of 2-ME(10, 20, 40 μmol/L). MM B16 cells were recorded in MM B16-negative cells without any treatment. Morphological changes of MM B16 cells were observed by inverted microscope after 48 h. The plate colony assay was used to testify the colony-formation ability of MM B16 cells treated with 2-methoxyestradiol for 2 weeks. The transwell assay was used to detect the capacity of invasion and migration of MM B16 cells treated with 2-methoxyestradiol in different concentrations. The wound healing assay was used to testify the capacity of migration of MM B16 cells treated with 2-ME at the concentrations of 10 μmol/L for 24 h. Results Compared with the control group the colony-formation ability of MM B16 cells treated with 2-ME was significantly inhibited(P<0.05). The capacity of invasion and migration of MM B16 cells treated with 2-ME was inhibited compared with the control group(P<0.05). The cells in the control group almost migrated to all the scratches. Only some scratches areas were occupied by cells in the 10 μmol/L experimental group. Conclusion 2-ME could inhibit the proliferation of MM B16 cell in a time-dose-dependent manner. 2-ME could inhibit the cloning ability of MM B16 cell. 2-ME could inhibit the capacity of invasion and migration of MM B16 cell.

melanoma； estradiol; neoplasm invasiveness; mice

2015-07-02；

2015-07-23

河北省医学科学研究重点课题(20130252)

胡彩霞(1982-)，女，河北衡水人，河北医科大学第四医院主治医师，医学硕士，从事皮肤病诊治及激光美容研究。

*通讯作者。E-mail:zgq810328@sina.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.04.010

R739.5

A

1007-3205(2016)04-0407-05

许卓文)