丁苯酞联合依达拉奉对局灶性脑梗死大鼠皮质血脑屏障及咬合蛋白表达的影响

王丽娜，王丽娟，胡振芳，刘世炎，刘永亮，王 鹏

(1.河北省唐山市人民医院神经外科， 河北 唐山 063000；2.河北省唐山市丰润区第二人民医院检验科，河北 唐山 063000；3.河北省唐山市中医医院彩超室， 河北 唐山 063000)



·论 著·

丁苯酞联合依达拉奉对局灶性脑梗死大鼠皮质血脑屏障及咬合蛋白表达的影响

王丽娜1，王丽娟2，胡振芳3，刘世炎1，刘永亮1，王 鹏1

(1.河北省唐山市人民医院神经外科， 河北 唐山 063000；2.河北省唐山市丰润区第二人民医院检验科，河北 唐山 063000；3.河北省唐山市中医医院彩超室， 河北 唐山 063000)

目的探讨丁苯酞联合依达拉奉对局灶性脑梗死大鼠皮质血脑屏障及咬合蛋白表达的影响。方法选取成年SD 雄性大鼠60只, 随机分为对照组、模型组、丁苯酞组、丁苯酞联合依达拉奉组，每组15只。各组于模型制作成功后72 h采用伊文思兰渗出法检测大鼠血脑屏障通透性变化，免疫组织化学和Western blot检测损伤区周围皮质咬合蛋白表达变化。结果与对照组比较，模型组、丁苯酞组、丁苯酞联合依达拉奉组梗死区大脑皮层血脑屏障通透性均增加，皮质咬合蛋白表达均减少。与模型组相比，丁苯酞组和丁苯酞联合依达拉奉组皮质脑组织伊文思蓝渗出量减少，皮质咬合蛋白表达增加。与丁苯酞组比较，丁苯酞联合依达拉奉组伊文思蓝渗出量减少，咬合蛋白表达量增加。结论丁苯酞软胶囊可保护血脑屏障，增加大脑皮质咬合蛋白的表达。与依达拉奉联合应用保护血脑屏障、增加咬合蛋白表达作用更明显。

脑梗死；血脑屏障；丁苯酞软胶囊；依达拉奉

急性脑梗死是目前临床常见的缺血性脑血管病，严重危害着人类的健康。脑水肿是急性脑梗死的主要病理过程之一，可加重脑梗死患者的脑组织损伤，影响患者的预后。丁苯酞对轻、中度急性缺血性脑卒中有明显的治疗作用[1]。依达拉奉具有清除自由基的作用，是临床常用的治疗急性脑梗死的药物[2]。丁苯酞联合依达拉奉在治疗急性脑梗死后脑水肿形成的研究尚未见报道。本研究采用伊文思蓝渗出等方法评价丁苯酞联合依达拉奉对急性局灶性脑梗死大鼠血脑屏障通透性的影响，并利用免疫组织化学和免疫印记(Western blot)来观察急性脑梗死后大鼠梗死灶周围皮质咬合蛋白表达的变化，探索丁苯酞联合依达拉奉治疗脑损伤后脑水肿的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物来源 清洁级3个月龄SD雄性大鼠60只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体质量280～320 g，许可证号：SCXK(京)2002-003。采用随机数字表法将60只大鼠分：对照组、模型组、丁苯酞组、丁苯酞联合依达拉奉组，每组15只。所有实验过程严格遵循科技部《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 局灶性脑梗死模型制备[1]所有大鼠给予10%水合氯醛3～5 mL/100 g腹腔注射麻醉。模型组、丁苯酞组、丁苯酞联合依达拉奉组给予玫瑰红B 15 mg/100 g体质量尾静脉注射，固定大鼠头部于立体定向仪上，常规消毒大鼠头部，沿正中线纵行切开头皮，暴露颅骨，于前囟右侧3 mm后2 mm处，牙科磨钻磨除颅骨外层形成一直径约6 mm颅骨缺损，冷光源[(LG-150，徐州恒发有限公司，波长(560±30) nm，光照强度5.6×105勒克斯，照射中心最高温度为27 ℃)]照射缺损处30 min，关闭切口。待大鼠麻醉清醒后，给予Longa法行为学评分[3]，1～3分者视为模型制作成功。对照组给予0.3 mL生理盐水尾静脉注射，暴露颅骨并磨除外板后给予冷光源照射，时间同上。模型组和对照组每日给予0.4 mL植物油灌胃、0.3 mL生理盐水腹腔注射。丁苯酞组每日给予丁苯酞软胶囊40 mg/kg植物油稀释成0.4 mL后灌胃、0.3 mL生理盐水腹腔注射2次/d。丁苯酞联合依达拉奉组每日给予丁苯酞软胶囊40 mg/kg灌胃、依达拉奉3 mg/kg生理盐水稀释成0.3 mL腹腔注射2次/d。

Longa行为学评分标准：0分，无神经功能缺损；1分，不能伸展对侧前肢；2分，对侧前肢屈曲；3分，轻度向对侧转圈；4分，严重向对侧转圈；5分，向对侧跌倒。

1.3 血脑屏障通透性测定 各组大鼠于术后71 h尾静脉注射20 g/L伊文思蓝3 mL/kg。术后72 h给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉， 37 ℃生理盐水经左心室穿刺至主动脉进行灌注，直至右心耳流出清亮液体为止。断头取脑，取梗死灶周围皮质约200 mg，电子天平称质量后，3 mL二甲基甲酰胺浸泡，37 ℃温水浴48 h，1 500 r/min,离心10 min，取上清液，酶标仪检测630 nm波长吸光度(A)值，从标准曲线上查得伊文思蓝含量。

1.4 免疫组织化学 各大鼠等部位切片3张，脱蜡，脱水，双氧水消除内源性过氧化物酶，高压热修复，1∶100比例稀释的咬合蛋白一抗浸泡，4 ℃冰箱内过夜，次晨取出置常温，滴加二抗，37 ℃孵育1 h，二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色，苏木精复染，脱水，透明，封片。光镜下观察细胞核呈蓝色，阳性细胞肿胀，包浆黄染。显微镜下(×400)随机选取梗死灶周围皮层5个视野，Image-Pro-Plus图像分析系统(美国Media Cybernetics公司)照相后计算每个视野中阳性细胞数目。

1.5 Western blot 细胞裂解液提取各组大鼠梗死灶周围脑组织总蛋白，应用考马·斯亮蓝比色法测定各个样本蛋白含量，上样量为100 μg蛋白。进行电泳，转膜；山羊抗咬合蛋白多克隆一抗(1∶500稀释) ，山羊抗actin多克隆一抗(1∶1 000稀释)，4 ℃过夜，次日加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶1 000稀释)杂交。EcL发光剂3 min，曝光，显影，定影。数码成像分析系统软件分析各条带平均灰度值，以目标的平均灰度值比内参的平均灰度值百分比的大小作为分析对象进行比较。

2 结 果

模型组脑组织伊文思蓝渗出量较对照组明显增加，丁苯酞组较模型组明显减少，丁苯酞联合依达拉奉组渗透最少(均P<0.05)；咬合蛋白量的表达(包括免疫组织化学法和Westernblot法),模型组较对照组明显较少，丁苯酞组较模型组明显增多，丁苯酞联合依达拉奉组增加最多(均P<0.05)。见表1，图1、2。

表1 各组动物血脑屏障通透性比较

Table 1 Comparison of blood-brain barrier permeabilities in each groups

组别 血脑屏障通透性(μg/g)咬合蛋白表达量免疫组织化学(个/HP)Westernblot(%)对照组18.00±10.93183.20±6.18144.56±8.43模型组321.20±14.26*55.20±5.26*54.10±6.39*丁苯酞组280.60±13.81*#93.20±5.89*#87.04±5.51*#丁苯酞联合依达拉奉组203.60±19.87*#△135.60±5.13*#△120.06±4.50*#△ F397.709478.798190.930 P0.0000.0000.000

*P<0.05与对照组比较 #P<0.05与模型组比较 △P<0.05与与丁苯酞组比较(SNK-q检验)

图1 梗死周围皮质咬合蛋白阳性细胞数(免疫组织化学染色 ×400)

A.对照组;B.模型组;C.丁苯酞组;D.丁苯酞联合依达拉奉组

Figure 1 Cell numbers in occludin positive cells in cortex of focal cerebral infarction (immunohistochemistry ×400)

图2 梗死周围脑组织咬合蛋白表达

Figure 2 Protein expresssions of occludin in cortex of focal cerebral infarction

3 讨 论

国内外大量文献研究表明，脑水肿是急性脑梗死后重要的病理过程之一，是影响急性脑梗死患者病情严重程度及预后的重要因素。而血脑屏障通透性的增高是引起急性脑梗死后脑水肿的重要原因。

血脑屏障是血液与脑组织及脑脊液之间的通透性较低的膜性结构，主要有脑毛细血管内皮细胞、基膜和神经胶质细胞的足突组成，对维持中枢神经系统内环境的稳定和防止有害物质进入有非常重要的作用。当缺血、缺氧、炎症反应等因素作用于血脑屏障时，可造成血脑屏障基本结构的破坏，从而导致血脑屏障通透性增高，血浆蛋白等大分子物质通过血脑屏障进入脑组织，脑组织胶体渗透压增高，脑水肿形成[4]。

丁苯酞是我国自行研制的一类治疗急性缺血性脑血管病的新药，具有减轻血脑屏障通透性增高[5]、抑制脑损伤后炎症反应发生[6]、减轻缺血引起神经功能损伤[7]等作用。张学兰等[8]研究表明，丁苯酞注射液对进展性脑梗死有明显的治疗作用。

依达拉奉是临床常用的治疗急性脑梗死的药物，具有60%的血脑屏障通透率。依达拉奉是一种自由基捕获剂，具有降低自由基浓度的作用，可明显抑制自由基引起的脂质过氧化，减少迟发性神经元死亡[2]。

咬合蛋白是形成紧密连接的主要跨膜蛋白，而脑微血管紧密连接是形成血脑屏障的基础，与脑水肿的关系密切。在生理情况下，血脑屏障的紧密连接能对流经脑血管内的绝大多数物质进行严格选择，限制其进入脑组织，维持脑内环境的稳定。紧密连接的结构完整性是保障血脑屏障功能正常发挥的前提。跨内皮细胞电阻可反映内皮细胞的屏障通透性，咬合蛋白含量越高，跨内皮细胞电阻也越高，而血脑屏障通透性则越小，反之亦然。咬合蛋白表达减少，紧密连接的破坏将导致血脑屏障通透性增高，脑水肿形成[9]。研究表明丁苯酞具有抑制弥漫性脑损伤大鼠皮层咬合蛋白表达的作用[10]。本研究结果表明急性脑梗死后脑组织可能通过减少梗死灶周围皮层咬合蛋白的表达，导致血脑屏障通透性增加，脑水肿加重，而丁苯酞软胶囊可减少咬合蛋白的破坏，从而减轻血脑屏障通透性的增加，减轻脑水肿；丁苯酞与依达拉奉联合应用咬合蛋白破坏量更少，保护血脑屏障通透性作用更明显。

综上所述，丁苯酞对急性脑梗死具有明显的治疗作用，丁苯酞与依达拉奉联合应用保护血脑屏障的作用更明显，可能与两药联合应用减轻炎症反应、抑制自由基密切相关。

[1] 王鹏,王丽娜,刘永亮,等.丁苯酞对局灶性脑缺血大鼠脑水肿和梗死周围组织磷酸化肌球蛋白轻链表达的影响[J].国际脑血管病杂志,2014,22(5)：376-380.

[2] 林昌福,于朝春,齐一龙.依达拉奉对脑出血大鼠脑组织含水量、肿瘤坏死因子-α含量、血清基质金属蛋白酶-9水平和超氧化物歧化酶活性的影响[J].临床神经病学杂志,2012,25(5):362-364.

[3] 张春梅,王丽娜,刘永亮.丁苯酞对局灶性脑梗死大鼠皮层Rho相关激酶Ⅱ蛋白表达的影响[J].河北医科大学学报,2014,35(9):1003-1005.

[4] 侯景明,黎海涛.血脑屏障破坏与脑水肿发生研究进展[J].国际神经病学神经外科学杂志,2010,37(3):260-263.

[5] 纪海茹，孔令伟，孔维，等.丁苯酞对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障的影响[J].中华老年心脑血管病杂志,2015,17(3):307-309.

[6] 牛慧艳，张占强，魏美玲，等.丁苯酞对脑梗死后相关炎性因子的影响研究进展[J].中国实用神经疾病杂志,2015,18(9):124-125.

[7] 王建,董力,贾晨红.丁苯酞注射液对急性脑梗死患者神经功能及脑血管储备功能的影响[J].实用临床医药杂志,2015,19(11)：117-118.

[8] 张学兰,段薇静,赵延宁,等.丁苯酞注射液治疗进展性脑梗死的疗效观察[J].河北医科大学学报,2015,36(5):565-567.

[9] 常玉坤,王丽娜,刘永亮,等.弥漫性脑损伤大鼠血脑屏障及损伤区皮质咬合蛋白表达的变化[J].疑难病杂志,2013,12(9):702-705，后插1页.

[10] 孙东良,王丽娜,刘永亮,等.丁苯酞对弥漫性脑损伤大鼠脑水肿及皮层基质金属蛋白酶9、咬合蛋白表达的影响[J].河北医科大学学报,2014,35(7):756-760.

Effects of butylphthalide combined with edaravone on blood-brain barrier permeability and occludin expressions in cortex of focal cerebral infarction in rats

WANG Li-na1, WANG Li-juan2, HU Zhen-fang3,LIU Shi-yan1, LIU Yong-liang1, WANG Peng1

(1.Department of Neurosurgery, the People's Hospital of Tangshan City, Hebei Province, Tangshan 063000, China; 2. Department of Laboratory, the Second People's Hospita of Fengrun District,Hebei Province, Tangshan 063000, China; 3. Department of Color Ultrasonic Room,the Hospital of Traditional Chinese Medicine of Tangshan City, Hebei Province,Tangshan 063000, China)

Objective To explore the effects of butylphthalide combined with edaravone on blood-brain barrier permeability and occludin expressions in cortex of focal cerebral infarction in rats. Methods Sixty sprague-dawley male rats were randomly divided into four groups: control group, model group, butylphthalide group and butylphthalide combined with edaravone group, with 15 rats in each group. The model was established based on the principle of photochemical initiation of thrombosis. At 72 h after injury, evans blue extravsation method was used to detect the blood-brain barrier permeability. Immunohistochemistry and western blot were used to examine the cortex occludin expression around the infarction area. Results Compared with the control group, the blood-brain barrier permeabilities in the model group, butylphthalide group and the butylphthalide combined with edaravone group were increased significantly. And the occludin expressions aroud the infarction were upregulated significantly. Compared with the model group: evans blue extravsations in cortex in the butylphthalide group and in the butylphthalide combined with edaravone group were decreased, and the occludin expressions aroud the infarction area were increased. Compared with the the butylphthalide group: evans blue extravsation in cortex in the butylphthalide combined with edaravone group was decreased, and the occludin expression aroud the infarction was increased. Conclusion Butylphthalide could protect the bolld-brain barrier, and increase the expression of occludin. The effect was more obvious by using the combination of butylphthalide and edaravone.

brain infarction; blood-brain barrier; butylphthalide; edaravone

2015-09-14；

2015-11-03

王丽娜(1976-)，女， 河北唐山人，河北省唐山市人民医院主管护师，医学学士，从事临床护理学研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.04.004

R743.33

A

1007-3205(2016)04-0385-04

许卓文)