高效液相色谱法测定不同产地虾仁中的甲醛残留

庞维荣，张　强，王　瑞（山西中医学院，山西太原030024）



高效液相色谱法测定不同产地虾仁中的甲醛残留

庞维荣，张强，王瑞
（山西中医学院，山西太原030024）

摘要目的：采用高效液相色谱法建立不同产地虾仁中甲醛残留含量的测定方法，为评价虾仁的质量提供依据。方法：以2，4-二硝基苯肼（2，4-DNPH）为衍生试剂，在冰乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH=5）中反应，使甲醛转化为相应稳定的甲醛-2，4-二硝基苯腙，利用二极管阵列检测器进行测定。结果：甲醛峰面积与浓度在2 μg/mL～20 μg/mL范围内呈良好的线性关系，相关系数r= 0.999 2；回收率为71.12%～73.50%，方法检出限为5 mg/kg；相对标准偏差RSD小于5.7%。结论：该方法的精密度、稳定性和重复性均良好，可用于虾仁中甲醛的限量检查。

关键词虾仁；甲醛；含量测定；高效液相色谱法

虾仁营养丰富，且肉质松软，易消化，对身体虚弱以及病后需要调养的人是极好的养生保健食物。然而随着人们对虾需求量逐年增大，有些渔民和不法商贩由于经济利益的驱使，经常向浸泡液中加入非食品用的添加剂甲醛，其主要目的是为了保持虾的新鲜，延长保质期，改善外观，增加口感和起到定型的作用［1］。甲醛为具有刺激性臭味的无色可燃性液体，易溶于水，具有十分活泼的化学与生物学活性，对人体的毒性主要表现为嗅觉异常、刺激、致敏、免疫毒性、神经毒性、脑损伤等，长期接触将导致人体基因突变引发许多器官恶性肿瘤的形成［1-7］。国际癌症研究机构（IARC）已于2004年将其列入第1类致癌物。本研究建立了高效液相色谱测定虾仁中甲醛含量的方法，本方法准确可靠、快速、稳定，具有较好的应用、普及和推广价值。

1仪器与试药

高效液相色谱仪（Waters 515 2996检测器，美国Waters公司）、FA/JA 1004型万分之一电子天平（上海天平仪器厂）、HH-2恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂）、涡旋混合器（赛智科技杭州有限公司）、HC-2518高速离心机（北京东南仪诚实验室设备有限公司）、10 mm×150 mm具塞玻璃层析柱、25 μL微量进样器、15 mL具塞比色管、0.45 μm微孔滤膜。

甲醇为色谱纯，二氯甲烷、2，4-二硝基苯肼、无水硫酸钠均为分析纯，水为乐百氏纯净水，甲醛标准溶液（100 mg/L购自国家标准物质中心）。虾仁药材来源如表1所示。

表1　虾仁来源

2方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1 2，4-二硝基苯肼溶液的制备称取100 mg 2，4-二硝基苯肼，精密称定，溶解于24 mL浓盐酸中，加水定容至100 mL，即得［8］。

2.1.2甲醛储备液的制备精密移取甲醛（100 mg/L）标准溶液5 mL至25 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，配制成每1 mL含甲醛20 μg的标准储备液。

2.1.3甲醛对照品溶液的制备分别取甲醛标准储备液0 mL、0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL、0.75 mL、1.0 mL于15 mL具塞比色管中，加蒸馏水至1 mL，加0.2 mL 2，4-二硝基苯肼溶液，置60℃水浴15 min，然后在流水中快速冷却，加入2 mL二氯甲烷，涡旋混合器振荡萃取1 min，3 000 r/min离心2 min，取上清再用二氯甲烷萃取2次，每次1 mL，合并3次萃取的下层黄色溶液，将萃取液经无水硫酸钠脱水，60℃水浴蒸干，放冷，用甲醇定容至1 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得空白溶液和浓度分别为2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL的甲醛与2，4-二硝基苯肼衍生物溶液。

2.1.4供试品溶液的制备取虾仁药材粉末（过四号筛）1g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，加入10 mL蒸馏水，置于40℃恒温振荡器中，40 r/min振摇提取2 h，3 500 r/min离心3 min，取上清2 mL于15 mL具塞比色管中，照“2.1.3”项下，自“加0.2 mL 2，4-二硝基苯肼溶液”起，依法操作，即得供试品溶液［9］。

2.2色谱条件

按《中华人民共和国水产行业标准》SCT 3025-2006水产品中甲醛测定的高效液相色谱法进行测定。色谱柱：DiamonsiL RP-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇∶水（60∶40），流速：0.5 mL/min，柱温：室温，检测器：二极管阵列检测器，检测波长：338 nm，进样量：20 μL。

2.3线性范围考察

分别精密吸取“2.1.3”项下的各对照品溶液20 μL注入高效液相色谱仪，测定其峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。甲醛的回归方程为y=338 620x+69 015，r=0.999 2，线性范围为2 μg/mL～20 μg/mL。

2.4精密度实验

照高效液相色谱法（附录VID）实验，精密吸取“2.1.3”项下10 μg/mL对照品溶液20 μL，注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件，重复测定6次，计算甲醛峰面积积分值的RSD值为2.3%，结果表明仪器精密度良好。

2.5重复性实验

称取北极虾（20111009）药材粉末（过四号筛）6份，每份1g，精密称定，照“2.1.4”项下方法制备，得北极虾药材的样品溶液1、2、3、4、5、6。分别精密吸取上述溶液20 μL，依法测定，计算甲醛含量的RSD值为2.9%，结果表明方法的重复性良好。

2.6加样回收率实验

称取已知含量的北极虾（20111009）药材粉末（过4号筛）9份，每份1g，精密称定，每3份分别加入100 mg/L的甲醛对照品溶液50 μL、100 μL、200 μL，照“2.1.4”项下方法制备，得加样回收率实验的样品溶液1、2、3、4、5、6、7、8、9。

分别精密吸取上述溶液20 μL，注入高效液相色谱仪中，按上述的色谱条件进行测定，计算甲醛的加样回收率和RSD值，结果如表2所示。甲醛加样回收率为71.12%～73.50%，RSD值为3.9%～5.7%，结果表明方法的准确度良好。

表2　加样回收率实验　（n=9）

2.7检出限

精密量取“2.1.2”项下的甲醛对照品溶液适量，照“2.1.4”项下方法制备，调节对照品加入量，进样并记录色谱图，在S/N＞3时，甲醛的检出限为5 mg/kg。

2.8样品含量测定

按照上述方法，分别测定中国对虾样品3批、日本对虾样品3批、凡纳滨对虾样品2批、鹰爪虾样品1批、脊尾白虾样品2批、北极虾样品1批，色谱图如图1所示，结果见表3。

3讨论

《中华人民共和国农业行业标准》（NY/T840-2004）“虾的理化要求”项下规定，甲醛不得超过10.0 mg/kg，即百万分之十。12批虾仁有9批（中国对虾20111008、中国对虾20111025、中国对虾20111111、日本对虾20111120、凡纳滨对虾20111008、凡纳滨对虾20111120、鹰爪虾20111008、脊尾白虾20111008、北极虾20111009）甲醛测定结果超过了百万分之十（10 ppm），因此应将甲醛的含量限度纳入虾仁的质量标准中。

图1　甲醛HPLC色谱图

表3　不同批次虾仁样品中甲醛的含量

本研究采用回旋振荡提取、2，4-二硝基苯肼衍生化、HPLC法测定虾仁中的甲醛含量，取得满意结果，重现性和稳定性较好，为大批量虾仁中甲醛的测定及质量控制提供了一种快速、高效、可靠的方法。

参考文献

［1］张崇华，闫海，刘晓慧.甲醛毒性的研讨［J］.医学创新研究，2006，3（5）：62-63.

［2］林妃妃，陈娇桂.某海鲜市场海产品甲醛含量的抽样调查［J］.大众科技，2011（5）：114-115.

［3］李一乔，陈浩浩，尹一飞，等.甲醛吸入对大鼠嗅球和海马神经细胞的影响［J］.浙江大学学报：医学版，2010，39（3）：272-278.

［4］朱桂珍.甲醛中毒的诊断与治疗［J］.中毒与急救，2006，4（1）：57-60.

［5］梁瑞峰，袁福胜，白剑英，等.甲醛对小鼠的免疫毒性及氧化损伤的研究［J］.环境与健康杂志，2007，24（6）：396-398.

［6］邹志飞，吴赤蓬，郑立新，等.甲醛的毒物兴奋效应及其所致损害的实验研究［J］.职业与健康，2012，26（7）：721-725.

［7］童志前，韩婵帅，苗君叶，等.内源性甲醛异常蓄积与记忆衰退［J］.生物化学与生物物理进展，2011，38（6）：575-579.

［8］国家水产品质量监督检验中心.水产品中甲醛的测定［M］.北京：中国农业出版社，2006.

［9］中华人民共和国浙江出入境检验局和中华人民共和国黑龙江出入境检验局.进出口食品中甲醛含量测定-液相色谱法［M］.北京：中国标准出版社，2005：1 547-2 005.

（编辑：梁葆朱）

Conclusion：The method hasgood precision degree，stability and reproducibility and could be used for limited examination of formaldehyde in the shrimp.

Determination of formaldehyde in shrimp from different areas by HPLC

Pang Weirong，Zhang Qiang，Wang Rui
（Shanxi College of TCM，Taiyuan Shanxi 030024）

AbstractObjective：To develop a method for determinating the content of formaldehyde in shrimp from different areas，and provide a basis for evaluating the quality of shrimp.Methods：2，4 dinitrophenyl hydrazine（2，4-DNPH）was used as derivative reagent in this study，and reaction was carried out inglacial acetic acid-sodium acetate buffer solution（pH=5）so that formaldehyde could converted to formaldehyde-2，4 dinitrophenyl hydrazone.Content of formaldehyde was determinated by diode array detector.Rusults：Thegood linear range of formaldehyde was 2 μg/mL～20 μg/mL（r=0.999 2），the recovery rate was 71.12%～73.50%，the detection limit was 5 mg/kg，and the relative standard deviation（RSD）was less than 5.7%.

Key wordsshrimp；formaldehyde；content determination；HPLC

中图分类号：R284.1

文献标识码：A

文章编号：1671-0258（2016）02-0026-03

［基金项目］山西中医学院博士基金资助项目

［作者简介］庞维荣，E-mail：wrgreentea@163.com