威宁绵羊和贵州半细毛羊FecB基因SNP分析

王 振，申小云，盘道兴，谢海强，刘若余

（1.贵州大学动物科学学院/贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州省扶贫办公室外资项目管理中心，贵州 贵阳 550004；3.西南科技大学生命科学院，四川 绵阳 621010）



威宁绵羊和贵州半细毛羊FecB基因SNP分析

王 振1，申小云2，3，盘道兴1，谢海强1，刘若余1

（1.贵州大学动物科学学院/贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州省扶贫办公室外资项目管理中心，贵州 贵阳 550004；3.西南科技大学生命科学院，四川 绵阳 621010）

摘 要：利用威宁绵羊和贵州半细毛羊构建DNA池，设计11对引物扩增其FecB基因外显子和部分内含子的序列，对纯化后的PCR产物双向测序，分析确定多态性位点。然后利用生物信息学软件分析SNPs位点对FecB基因RNA二级结构、FecB蛋白结构的影响。结果显示，在扩增的FecB基因中筛选到10个SNPs，其中exon5-A39G、exon9-C37A、exon11-C87A、intron2-A62G、intron4-A1023G、intron10-G24A 突变为威宁绵羊和贵州半细毛羊中所共有，而exon9-A8G和intron1-G243A 突变为威宁绵羊所特有，intron3-G177A和exon8-T86C 突变为贵州半细毛羊所特有。上述的SNPs中，exon5-A39G 和exon9-A8G为错义突变，exon5-A39G突变导致编码的异亮氨酸（Ile）变为缬氨酸（Val），exon9-A8G突变导致编码的天冬酰胺（Asn）变为天冬氨酸（Asp）； exon9-C37A和exon11-C87A多态位点均未改变氨基酸的编码，为同义突变。

关键词：FecB基因；威宁绵羊；贵州半细毛羊；单核苷酸多态性（SNP）

威宁绵羊主产于贵州省威宁县，为粗毛羊，体质结实，特别能适应贵州威宁等海拔较高的山区养殖，但其个体较小，生长速度十分缓慢，繁殖率低，产单羔。因此，提高威宁绵羊的繁殖率育种工作具有重要意义。

贵州半细毛羊是20世纪80年代毕节市牧科所参与培育出的第1个绵羊品种，由新疆细毛公羊与贵州本地粗毛母羊杂交组合，将杂交二代母羊考力代公羊作级进杂交，育成考细杂羊，进而在考细杂和部分罗细杂、罗考细杂组合的后代中选择理想型公母羊横交固定，最终育成达到育种目标的贵州半细毛羊。贵州半细毛羊繁殖率低，因此有必要对贵州半细毛羊作进一步培育，提高其繁殖率，使其成为同时符合肉用市场和毛用市场需求的毛肉兼用型贵州半细毛羊品种［1］。

FecB基因是Davis［2］在20世纪80年代从布鲁拉美利奴（Booroola Merino）绵羊中发现的。当时，Davis认为该基因有可能是增加布鲁拉美利奴绵羊排卵数和产羔数的一个染色体突变基因。在绵羊的高繁殖力的主效基因中，FecB基因是第1个被识别出的。该基因在1989年被绵、山羊遗传命名委员会正式命名为FecB基因［3］。Lord 等［4］利用微卫星BM1329和OarAE101作标记对FecB基因进行研究，发现FecB基因位于6号染色体的BM1329和OarAE101之间10 cM连锁群中。

FecB 基因对绵羊的的生理有多方面的影响，其中最为显著的生理作用体现在对卵巢排卵卵泡数量和大小的影响。有研究发现，不携带 FecB基因的野生型母羊成熟并排卵的卵泡直径都显著大于携带有FecB基因的母羊（基因纯合和基因杂合）［5］，并且不携带FecB基因的野生型母羊小卵泡所含有的颗粒细胞比携带FecB基因纯合的母羊多得多。Wilson等［6］发现，FecB基因第7外显子发生1处突变（A746G），突变导致了第249位氨基酸由谷氨酰胺（Gln）突变为精氨酸（Arg），造成布鲁拉美利奴绵羊排卵数明显增加。李达等［7］利用PCR－SSCP以及PCR－RFLP方法对湖羊、小尾寒羊、阿勒泰羊、洼地绵羊的FecB基因进行SNP分析，研究结果显示，上述4个绵羊品种均携带FecB突变，且能证明FecB 基因为洼地绵羊高繁殖力的主效基因。

本试验构建威宁绵羊、贵州半细毛羊进行DNA池［8］，对FecB基因的SNP多态性位点进行筛选，并作生物信息学分析，估算基因频率，探究SNP位点对RNA二级结构、蛋白质结构的影响，为研究该基因对绵羊生产性能的影响奠定基础，同时还为威宁绵羊和贵州半细毛羊的选种选育工作提供依据。

1　材料与方法

1.1 试验材料

威宁绵羊血样61个由威宁县畜禽品种改良站提供；贵州半细毛羊血样60个采自贵州省毕节市威宁县威宁种羊场。Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒（血液）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取与DNA池构建 本试验采用血液Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒提取威宁绵羊和贵州半细毛羊血样的DNA，绵羊血样DNA基因组的提取效果通过琼脂糖凝胶电泳进行检验，DNA浓度则利用紫外分光光度计进行检测，并将DNA基因组的浓度分别调整到100 ng/μL。然后分别将威宁绵羊和贵州半细毛羊的DNA样品每个各取5μL混合，构建两个DNA池。

1.2.2 引物设计和DNA扩增 通过NCBI数据库查找绵羊FecB基因的DNA序列（GenBank登录号：NC_019463.1），再利用NCBI的在线软件Primer-BLAST设计11对特异性引物。各对特异性引物对应的最适退火温度见表1。PCR扩增采用鼎国生物公司生产的Mix，反应体系总体积为30μL，将扩增的PCR产物利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，再运用凝胶成像仪对试验的凝胶电泳结果进行拍照，并观察各对特异性引物PCR扩增的效果。

表1　引物序列、退火温度及目的片段长度

1.2.3 序列分析 PCR产物纯化后由北京诺萨基因公司对其进行双向测序，运用DNAstar软件对测序结果进行校正对比，再通过BLAST软件分析确定单核苷酸多态性。

1.2.4 测序图峰高测量及等位基因频率估算 试验所测得结果图峰采用MWSnap软件测量等位基因对应的峰高，再根据公式Ai=Bi/（B1+B2），估算等位基因频率［9］。式中i=1，2，Ai表示SNP位点等位基因频率，B1和B2分别表示测序结果上该SNP等位基因1、2相对应的峰高。

1.2.5 FecB的RNA二级结构预测及蛋白结构分析 利用http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi在线软对RNA的二级结构进行预测；通过https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.htm l在线软件对蛋白质的二级结构进行预测；通过http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/ phyre2/htm l/page.cgi？id=index在线软件对蛋白质的三级结构进行预测。

2　结果与分析

2.1 DNA池的PCR产物测序

图1　PCR扩增电泳结果

运用PCR技术扩增出威宁绵羊和贵州半细毛羊的FecB基因的部分序列（图1）。将扩增产物常规纯化，然后进行双向测序。利用BLAST软件分析测序结果，共发现10个SNPs（图2），以各个外显子第1位碱基数分别为1，SNPs分别为：exon5-A39G、exon9-C37A、exon11-C87A、intron2-A62G、intron4-A1023G、intron10-G24A 、exon9-A8G、intron1-G243A、intron3-G177A和exon8-T86C。上述的SNPs中exon5-A39G 和exon9-A8G为错义突变，exon5-A39G突变导致编码的异亮氨酸（Ile）变为缬氨酸（Val），exon9-A8G突变导致编码的天冬酰胺（Asn）变为天冬氨酸（Asp）；exon9-C37A和exon11-C87A多态位点均未改变氨基酸的编码，为同义突变；intron2-A62G、intron4-A1023G、intron10-G24A、intron1-G243A和intron3-G177A均在内含子区，不参与氨基酸编码。

2.2 SNPs等位基因频率估算

运用MWSnap软件测量威宁绵羊和贵州半细毛羊等位基因峰的高度，估算等位基因的频率。从表2可以看出，除exon11-C87A位点两种绵羊差异较小外，不同绵羊品种同一突变位点和不同突变位点突变频率相差较大。

2.3 FecB的RNA二级结构分析

预测各SNP突变位点突变前和突变后FecB基因的RNA二级结构，通过预测结果可以看出，突变引起RNA二级结构的自由能发生变化，突变前最小自由能为-2564.92 kJ/mol，突变后exon5-A39G、exon8-T86C、exon9-A8G、exon9-C37A、exon11-C87A最小自由能分别为-2630.02、-2169.11、-2593.91、-2502.16、-2505.67 kJ/mol。 RNA的二级结构及最小自由能的变化可能会使其稳定性受到影响，进一步影响蛋白质的翻译过程。

2.4 FecB蛋白二级分析

通过在线软件分析预测威宁绵羊和贵州半细毛羊FecB蛋白质二级结构突变前后的变化。结果表明，exon5-A39G在突变前后β转角、α螺旋、自由卷曲和延伸链均没有发生变化，而exon9-A8G在突变前后α螺旋、β转角和延伸链发生了变化，自由卷曲则没有发生变化（表3）。

2.5 突变前后FecB蛋白三级结构分析

预测突变前后蛋白质的三级结构对分析蛋白质的功能具有重要的意义，利用蛋白质三级结构的在线预测软件对FecB蛋白突变前后的三级结构进行分析，结果（图3）表明突变后多态位点导致FecB蛋白三级结构有所改变。

图2　PCR产物测序及BLAST分析结果

图3　FecB蛋白质三级结构变化

表2　等位基因频率估算结果

表3　FecB蛋白质突变前后二级结构分析结果

3　讨论

FecB基因的生物学功能十分重要，对绵羊的显著生理作用体现在对卵巢排卵卵泡数量和大小的影响，此外，FecB基因还促进绵羊排卵和发情。FecB基因对动物的生长性能具有非常大的影响。因此，对FecB基因的深入研究有助于改善威宁绵羊和贵州半细毛羊繁殖率低，个体间差异较大的现状，同时对加快威宁绵羊和贵州半细毛羊的遗传育种工作和提高相关产业的生产效益具有重大科学和社会经济价值意义。

本研究在威宁绵羊和贵州半细毛羊的FecB基因中检测得到10个SNPs位点，其中exon5-A39G、exon9-C37A、exon11-C87A、intron2-A62G、intron4-A1023G、intron10-G24A 的突变为威宁绵羊和贵州半细毛羊中所共有，而exon9-A8G和intron1-G243A 的突变为威宁绵羊所特有，intron3-G177A和exon8-T86C 的突变为贵州半细毛羊所特有。而exon5-A39G 和exon9-A8G为错义突变，exon5-A39G突变导致编码的异亮氨酸（Ile）变为缬氨酸（Val），exon9-A8G突变导致编码的天冬酰胺（Asn）变为天冬氨酸（Asp）； exon9-C37A和exon11-C87A多态位点均未改变氨基酸的编码，为同义突变。另外，在扩增的威宁绵羊和贵州半细毛羊FecB基因序列中，并未发现A746G突变。比较10个多态性位点等位基因频率，发现除exon11-C87A位点两种绵羊差异较小之外，不同绵羊品种同一突变位点和不同突变位点突变频率相差较大。exon5-A39G和exon9-A8G发生错义突变导致RNA的二级结构和自由能发生改变，最终可能会导致编码蛋白质的三级结构发生变化，这一变化最终是否对蛋白质的功能产生影响进而影响个体的生产性能还有待进一步验证。此多态位点对研究FecB基因对绵羊繁殖率的影响具有重要科学意义，为后续科学研究和生产实践奠定了一定的理论基础。

参考文献：

［1］ 李丽娟，申小云.贵州半细毛羊的培育历程与养殖现状［J］.贵州农业科学，2010，38（11）：182-184.

［2］ Davis G H.Fecundity genes in sheep［J］.Animal Reproduction Science，2004（82-83）： 247-253.

［3］ 姜运良，吴常信.Booroola Merino绵羊多胎基因FecB的研究进展［J］.中国畜牧杂志，1999，35（4）：51-53.

［4］ Lord E A，Lumsden J M，Dodds K G，et al.The linkage map of sheep chromosome 6 compared with orthologous regions in otherspecies［J］.Mammalian Genome，1996（7）： 373-376.

［5］ 钟秀全，史万玉，宫新城，等.黄芩白术与PXF对LPS诱导流产小鼠的保胎作用及子宫内IL-10含量的变化研究［J］.畜牧兽医学报，2005，36（ 5）：517-520.

［6］ Wilson T，Wu X Y，Juengel J L，et al.Highly prolific Booroola sheep have a mutationin the intracellular kinase domain of bone morphogenetic protein IB receptor（ALK-6） that is expressed in both oocytes and granulose cells［J］.Biol Reprod，2001，64（4）：1225-1235.

［7］ 李达，孙伟.绵羊FecB基因遗传多样性及其产羔数的关联分析［J］.畜牧兽医杂志，2012，31（2）：1-8.

［8］ Sham P，Bader J S，Craig I，et al.DNA pooling： a tool for large-scale association studies［J］.Nature Reviews Genetics，2002，3（11）： 862-871.

［9］ Su liman H B，Carraway M S，Piantadosi C.A.Postlipopolysaccharide oxidative damage of m itochond rial DNA［J］.American jou rnal of respiratory and critical care medicine，2003，167 （4）： 570-579.

（责任编辑崔建勋）

SNP analysis of FecB in Guizhou sem i-fine wool sheep and Weining sheep

WANG Zhen1，SHEN Xiao-yun2，3，PAN Dao-xing1，XIE Hai-qiang1，LIU Ruo-yu1

（1.College of Animal Sciences，Guizhou University/ Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region，Ministry of Education，Guiyang 550025，China；2.Foreign Project Management Center of Guizhou Provincial Poverty Alleviation Office，Guiyang 550004，China；3.College of Life Science，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China）

Key words：FecB gene；Weining sheep；Guizhou semi-fine wool sheep；single nucleotide polymorphism（SNP）

Abstract：The DNA pond was constructed by using Weining sheep and Guizhou sem i-fine wool sheep.11 pairs of primers were designed to amplify exons and part of intron sequences of FecB gene，then the purified PC R products were bi-directional sequenced to analyze polymorphic sites.Bioinformatic software was used to analyze the influences of SNPs sites on RNA secondary structure and protein structure.The results showed that 10 SNPs were screened，of which exon5-A39G，exon9-C37A，exon11-C87A，intron2-A62G，intron4-A1023G，intron10-G24A mutations were located in both Weining sheep and Guizhou semi-fine wool sheep，however，exon9-A8G and intron1-G243A mutations were peculiar to Weining sheep，and exon8-T86C and intron3-G177A mutations were peculiar to Guizhou semi-fine wool sheep.Exon5-A39G and exon9-A8G were missense mutations in the above SNPs.The exon5-A39G mutation led to encoding isoleucine （Ile） into valine （Val） and the exon9 - A8G mutation led to encoding asparagine （Asn） into aspartic acid （Asp）.The exon9-C37A and exon11-C87A polymorphisms which were synonymous mutations did not change amino acid encoding.

中图分类号：S813.3；Q346+.5

文献标识码：A

文章编号：1004-874X（2016）01-0130-06

收稿日期：2015-08-27

基金项目：贵州省优秀教育人才省长专项（黔省专合字［2009］129）；国家现代农业产业技术体系（CARS-40-30）

作者简介：王振（1991-），男，在读硕士生，E-mail：614430446@qq.com

通讯作者：刘若余（1963-），男，博士，教授，E-mail：liury04@163.com