RUNX2基因rs1406846位点多态性与中国汉族女性TMJOA的相关性研究

肖佳灵　高金星　程刚

[摘要] 目的 本研究旨在评价RUNX2基因rs1406846位点多态性与中国汉族女性颞下颌关节骨关节炎的相关性。方法 依据颞下颌关节紊乱病研究诊断标准（RDC/TMD），共纳入240例受试者，包括114例TMJOA患者和126例健康的女性对照。运用测序的方法检测RUNX2基因上rs1406846位点的多态性，并采用Logistic回归模型对基因型、等位基因、携带频率分布进行统计学分析（SPSS 20.0）。结果 中国汉族女性TMJOA组中携带RUNX2-rs1406846上TT基因型和对照组的AA基因型相比具有统计学差异（P=0.032），T等位基因频率在TMJOA组中明显高于健康对照组（64.0% vs 54.4%， P=0.032）。结论 单核苷酸多态性研究显示，在中国汉族女性的TMJOA人群中RUNX2基因和TMJOA具有相关性，其中T等位基因可能是该疾病的危险因素。

[关键词] 颞下颌关节；骨关节炎；单核苷酸多态性；RUNX2

[中图分类号] R782.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）19-0001-04

[Abstract] Objective To evaluate the association between rs1406846 polymorphism of RUNX2 gene and temporomandibular joint osteoarthritis in Chinese Han females. Methods A total of 240 subjects， including 114 TMJOA patients and 126 healthy female controls were enrolled， according to the diagnostic criteria for temporomandibular disorders（RDC/TMD）. The polymorphism of rs1406846 locus of RUNX2 gene was detected by sequencing. And the genotype， allele and frequency distribution were analyzed by Logistic regression model（SPSS 20.0）. Results There was statistically significant difference between TT genotype of RUNX2-rs1406846 gene in the Chinese Han female TMJOA group and AA genotype in the control group（P=0.032）. T allele frequency was significantly higher in the TMJOA group than that in the healthy control group（64.0% vs 54.4%， P=0.032）. Conclusion The single nucleotide polymorphism study shows that there is correlation of RUNX2 gene and TMJOA in the TMJOA population of Han Chinese women， and the T allele might be the risk factor of the disease.

[Key words] Temporomandibular joint； Osteoarthritis； Single nucleotide polymorphism； RUNX2

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是以關节软骨的进行性破坏和损耗为主要病理学特征，伴有软骨下骨组织改建和滑膜相应病变的一种退行性疾病。该病发病隐匿，病程迁延，可导致功能障碍，严重影响患者的生活质量，临床上尚缺乏有效的治疗手段。目前认为OA是一种多基因参与的复杂性疾病，是由遗传因素和环境因素共同作用所致，遗传因素赋予患者疾病的易感性[1-3]。颞下颌关节（temporomandibular joint，TMJ）在颌面部的生长发育中起着重要作用，其结构和功能复杂，较易罹患骨关节炎。近年来，基因多态性与疾病易感性的分子流行病学研究迅速发展，作为第三代遗传标记，单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）在基因组中具有密度高、保守、稳定和易于分型的优点，在疾病特别是多基因疾病发病中具有重要作用。RUNX2是骨和软骨发育和分化重要的转录调控因子，并且在欧洲人群的全基因组关联分析中发现RUNX2和大关节的骨关节炎存在潜在的相关性[4]。RUNX2上多态性位点rs1406846和股骨与胫骨的发育长度存在明显的相关性，并且女性个体显示出更强的遗传相关性[5]。本研究通过DNA测序法对114例女性TMJOA患者和126例健康人进行检测，通过对两组人群进行比较，探讨RUNX2-rs1406846多态性位点与中国汉族女性TMJOA之间的相关性，为骨关节炎发病中遗传多态性的进一步研究提供相关依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2011年8月～2016年12月在本院口腔科就诊的汉族女性患者。TMJOA的诊断标准依据RDC/TMD（Research Diagnostic Criteria for Temporomandibular Disorders）标准进行[6]。临床诊断为颞下颌关节紊乱病，并行曲面体层、CBCT检查，影像学上至少一侧存在髁突磨平、硬化、骨质增生、破坏、囊样变等表现而确诊为OA的患者[7]（封三图 1 A、B和C）。所有病例均为散发病例，无家族史，病例组（TMJOA组）年龄12～60岁，平均（33.59±14.31）岁。健康对照：选取同时段内在本院口腔颌面外科就诊因正畸需要、阻生智齿需拔牙、修复需要行牙槽外科手术的患者以及部分院内职工和志愿者学生，全身情况良好，既往无颞下颌关节紊乱病及其他关节炎的病史，家族中亦无风湿、类风湿性关节炎及其他结缔组织疾病史，曲面体层或CBCT检查无明确OA者。对照组平均年龄（31.37±9.96）岁。病例组和对照组在年龄、性别等一般资料上具有可比性，所有患者均自愿参加本研究，入组前签署知情同意书。

1.2 样本收集

病例组与对照组均于空腹时一次性抽取外周静脉血2 mL于EDTA抗凝管中，-80℃保存。血样在24 h内进行处理、标记、登记、冻存。由专人负责将临床资料、一般情况等数据录入。

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA提取 基因组DNA提取采用常规的酚/氯仿提取法提取基因组DNA，并溶于TE缓冲液中，获得的基因组DNA用NanoDrop测OD值和浓度，-20℃保存备用。

1.3.2 引物 参照Gene Bank中RUNX2基因序列及相关文献设计合成引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，上游引物：5′-AGCATGGCACCCAATCCTTTA-3′，下游引物：5′-GCAAGGCTGTTTCCGATGAG-3′。

1.3.3 PCR反应 PCR反应体系25 μL：DNA模板（40 ng/μL）1 μL，引物P1、P2各0.5 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，Taq DNA聚合酶（1U/μL）0.5 μL，灭菌三蒸水19.5 μL。扩增程序为：94℃预变性2 min后进行30个循环，每个循环为98℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min。最后4℃保存。取PCR产物3 μL，用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离。

1.3.4 DNA测序 样品采用DNA测序方法对单核苷酸多态性位点进行检测分型，通过测序峰图对SNP位点进行比对分型，所有测序工作均由华大基因公司完成（中国）。

1.4 统计学处理

采用软件SPSS 20.0对多态性位点等位型、基因型和等位基因频率、所有样本的Hardy-Weinberg平衡检验进行统计分析，计数资料以百分比表示，组间两两比较用χ2检验，计量资料以（x±s）表示，多组间比较用Logistic回归模型，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR结果

扩增出的目的片段大小为475 bp，基因组DNA和PCR产物电泳结果见封三图 2。

2.2 测序峰图

根据测序后单核苷酸多态性分型结果，RUNX2基因rs1406846多态性位点基因型为TT型、TA型以及AA型。RUNX2-rs1406846位点的测序分型如封三图 3。

2.3 基因型和等位基因频率

入组的样本共240例，包括TMJOA组114例，健康对照组126例，均为中国汉族女性（具体入组样本信息见表 1）。单核苷酸多态性位点-rs1406846的基因型和等位基因频率满足哈迪温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium），TMJOA组和健康对照组在年龄上没有统计学差异[（33.59±14.31）歲 vs（31.37±9.96）岁，P=0.16]，排除年龄因素对分析结果的影响。

相关性检测分析发现RUNX2基因的SNP位点-rs1406846和中国汉族女性TMJOA易感性具有相关性。RUNX2-rs1406846上的T等位基因频率在TMJOA组明显高于健康对照组（64.0% vs 54.4%，P=0.032），且其在TMJOA中TT基因型和对照组的AA基因型比较具有统计学差异（P=0.032），而携带杂合子TA基因型的相比于AA基因型携带者未显著增加患TMJOA的风险（OR=1.71，95% CI：0.81～3.59，P=0.158）。见表 2。

3 讨论

颞下颌关节骨关节炎（temporomandibular joint osteoarthritis， TMJOA）是口腔颌面部的一种常见病，与大关节OA有许多类似的表现，但又有其自身特点。由于下颌髁突是颌面部的生长发育中心，TMJOA不仅影响颞下颌关节的功能运动，而且会影响颌面部的正常发育，造成下颌骨发育不良、错颌畸形等。因此，TMJOA不仅影响患者的生活质量，给患者带来严重的经济负担，还可能造成患者的心理障碍。骨关节炎的发展随着时间的推移逐渐加重并且早期症状往往不明显，因此开发与疾病进程相适应的治疗药物十分困难。另一方面，对OA早期患者缺乏有效的可供筛查的生物标记和敏感的检测技术，临床上也难以及时采取有效的治疗或干预措施。单核苷酸多态性具有分布广泛、高度稳定、易于自动化分析等优点，其反映了人群的遗传背景对疾病的易感性，是一种理想的生物学标志物。遗传修饰改变的检测对于疾病诊断、治疗以及药物研发具有重要的临床意义和应用前景[3]。目前研究较多的OA易感基因有生长分化因子5、雌激素受体基因、钙调蛋白基因-1、无孢蛋白基因、分泌型卷曲相关蛋白基因、白介素-1相关基因等[8，9]，但OA易感基因在不同性别、不同人种以及不同关节中有所差别，且其作用机制尚不明确，有待进一步研究。

RUNX2是转录因子RUNXX家族成员之一，作为一个具有多种功能的转录因子，具有调节肥大软骨细胞中X型胶原、磷蛋白、涎蛋白和MMP13表达的能力，被认为是晚期软骨细胞分化的关键调节分子[10-13]。为了维持软骨细胞的正常形态，在小鼠TMJ和膝关节的软骨表层细胞中，RUNX2的表达常常受到抑制[14]，而SMAD3本身可以通过促进Ⅱ型胶原的表达以及抑制RUNX2诱导的MMP13的表达，使软骨细胞外基质的合成和分解保持平衡[15]。RUNX2基因敲除小鼠表现出严重的软骨细胞分化延迟和软骨内成骨缺陷，并且具有显性抑制效应的RUNX2通过调控Ⅱ型胶原启动子区使小鼠表现出类似的软骨发育缺陷[16-18]。另一方面，RUNX2作为骨细胞的特异性转录因子，对骨组织的形成和重建也起着重要作用。RUNX2上多态性位点和骨骼的发育亦存在相关性，其上的SNP位点rs2819858、rs1406846、rs2819854和股骨和胫骨的长度存在明显的相关性[5]。Grcevic D等[19]学者通过外周血表达谱检测发现，RUNX2表达水平的改变可以作为类风湿性关节炎、OA等多种骨关节病中骨代谢水平的潜在标志物。Gelse K等[20]学者研究发现在人膝关节OA骨刺中对比正常关节软骨，RUNX2 mRNA表达水平升高12.7倍。本研究发现RUNX2-rs1406846和中国汉族女性TMJOA具有相关性，该SNP位点位于RUNX2的内含子区域，其遗传相关性可能通过和其他SNP位点连锁不平衡或影响RUNX2的表达或下游蛋白的功能，具体功能有待于进一步研究。

隨着遗传学与分子流行病学研究的迅速发展，SNPs与骨关节炎相关性的研究日渐深入，易感基因多态性的发现将有助于提高人们对OA发病机制的认识以及指导疾病的早期预防和治疗。尽管目前已经发现了不少OA易感基因，并对其SNPs位点进行了较多研究，但是对于同一基因同一SNP在不同关节、不同种族、不同性别以及不同年龄的研究结果并不完全一致[21]。本研究发现在中国汉族女性人群中，RUNX2基因上rs1406846多态性位点和颞下颌关节骨关节炎易感性具有相关性，其中T等位基因可能是该疾病的危险因素。该研究结果仅代表该多态性位点在中国汉族女性TMJOA中的分布情况，样本量较小，且未对其他种族和男性TMJOA人群进行相关性分析，以上结果为今后大样本、多中心的TMJOA遗传学研究提供初步的研究思路和实验依据。

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（收稿日期：2017-05-08）