杭州市区救护鸟类禽流感病原学检测结果

龚利洋，王才益，陈玎玎，应志豪，黄淑芳，陈　琳，陈　彬

(杭州市虎跑路杭州动物园，浙江杭州 310008)



杭州市区救护鸟类禽流感病原学检测结果

龚利洋，王才益，陈玎玎，应志豪，黄淑芳，陈琳，陈彬

(杭州市虎跑路杭州动物园，浙江杭州 310008)

摘要：为了解杭州市区救护野生鸟类禽流感病毒(AIV)的携带感染情况，2013 年-2015年期间，本研究对35种75只救护鸟类采集的口咽拭子样品，采用RT-PCR 方法并用AIV通用引物M-229进行了病原学检测，结果均为阴性。

关键词：禽流感； 病原检测；救护鸟类

禽流感(AI)是由禽流感病毒(AIV)引起的一种禽类烈性传染病，近年来在多个国家持续发生，造成重大经济损失的同时也严重威胁着人类的健康和安全。目前普遍认为野生鸟类是禽流感病毒的重要宿主及携带者[1-5]。

杭州市陆生野生动物救护中心救护的鸟类多为生活于市区的野鸟，与市民有着各种接触机会，如果携带有禽流感病毒，对市民和其它动物的健康和安全影响极大。笔者于2013-2015年间对杭州市区救护鸟类进行口咽拭子、肛拭子、血液样本采集，进行禽流感病原学检测和血清抗体检测，现将其中35种75只救护鸟类的口咽拭子病原学检测情况作一简要介绍，供参考。

1材料与方法

1.2样本处理在保证救护鸟类不受二次伤害的情况下，采用无菌棉签插入鸟类咽喉部擦拭，采集后置于装有500 μL lPBS溶液的1.5 mL离心管中，-70℃保存。

采集的口咽拭子经充分震荡，12000 rpm离心15 min，取上清液1.5 mL于离心管中，存入-70℃或即用。

1.3RT-PCR鉴定

1.3.1引物设计根据中华人民共和国农业行业标准NY/T772-2013，设计禽流感病毒的通用引物(详见表2)，送至上海生工生物工程技术有限公司合成。

表1　2013-2015年杭州市区救护鸟类禽流感

表2　禽流感病毒鉴定引物表

1.3.2RNA抽提参照《WHO动物流感诊断监测手册》，应用Trizol LS法直接从拭子浸出液中进行病毒总RNA提取。具体操作如下。

1.3.2.1250 μL样本上清液加入750 μL Trizol LS Reagent,混匀,室温静置5 min。

2)采用预先配制NaOH 10g-50 mLH2O溶液与K3Fe(CN)610g-50 mLH2O按1：1比例混合使用，金相试样腐蚀的时间为60 s。

1.3.2.2加入200 μL氯仿,振荡摇匀15 s，4℃ 12000 rpm离心10 min。

1.3.2.3取上清液于另一新Rnase-free离心管中,加同体积异丙醇,摇匀,静置10 min,12000 rpm离心10 min；弃上清,加1 mL 75%乙醇摇匀洗涤；12000 rpm离心5 min,弃上清,倒置于吸水纸上干燥5-10 min。

1.3.2.4取适量DEPC水于干燥后的离心管中摇匀溶解(必要时可55℃-60℃助溶10 min)。

1.3.3反转录合成cDNA

1.3.3.1取加入灭菌DEPC处理水的RNA 11 μL，加入12碱基通用引物(AGCAAAAGCAGG,12 μmol)1 μL，70℃温浴5 min后，立即置于冰上。

1.3.3.2加入5×reaction buffer 4 μL，RNA酶抑制剂1 μL，dNTP(10 mmol/L)2 μL，37℃温浴5 min。

1.3.3.3加入1 μL鼠源反转录酶，42℃温浴1 h，然后70℃ 10 min灭活反转录酶。

1.3.4PCR扩增在25 μL PCR体系中加入以下试液：10×PCR buffer 2.5 μL，rTaq 0.5 μL，dNTP(10 mM)0.5 μL，灭菌双蒸水19.5 μL，上引物(10 μM)0.5 μL，下引物(10 μM)0.5 μL，模板DNA 1 μL。PCR反应的循环参数为：94℃ 5 min；进入循环，94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，35个循环；72℃延伸10 min。反应结束后，取4.5 μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳(含0.5 μg/mL EB)，根据片段大小进行结果判断。

2结果与分析

对75只救护鸟类的口咽拭子样本进行禽流感病原学检测，结果均为阴性。详见图1。

图1　禽流感病原检测的RT-PCR核酸电泳图备注：M：marker ；1、2：为其中的2个样本；+：阳性对照；-：阴性对照

3小结与讨论

3.1目前对野鸟禽流感的流行病学调查对象主要是郊区、野外环境下的鸟类[6-10]，这些鸟类与人类的接触相对较少。而在杭州市区活动的野生鸟类与人类接触机会较多，一旦感染流感病毒对人、畜构成的安全威胁远远大于郊区鸟类。且浙江地区(包括杭州市区)的野鸟禽流感流行病学调查目前还未见报道。故本文将杭州市区野生鸟类作为研究对象可以从另一方面说明目前禽流感的流行状况，为禽流感的防控工作提供科学依据，并为救护中心的日后工作提供有效帮助。

3.2资料显示，杭州有鸟类306 种，隶属17 目49科[10]，本次检测对象有鸟类35种，隶属11目13科。虽然种类只占总数的11.4%(35/306)，但占总目数的64.7%(11/17)，说明本次研究对象在本地鸟类中有较广泛的代表性。隼形目和鸮形目各有19只，猛禽类占研究总数的50.6%(38/75)，超过半数。这与传统观念略有出入，分析原因可能有二：一是猛禽个体相对较大，受伤或患病后易被市民发现；二是在市区作为猛禽主要食物的小型啮齿类动物和小型鸟类较多，食物充沛导致大量猛禽移进市区。

3.3本次实验对75例样本进行检测，结果均为禽流感病原阴性，这与有关文献报道结果基本一致[9]。可能有如下原因所致：一是杭州市区鸟类确实没有感染禽流感病毒，是现实状况的真实反映；二是样本数量较少，据赵全邦等报道(2008)[7]在青海湖地区2403份样本中才检出10份病原阳性，检测率仅为0.4%。

参考文献

[1]Olsen B, Munster V J, Wallensten A, et al. Global patterns of influenza a virus in wild birds[J].Science,2006(312):384-388.

[2]Ellisa M T, Bousfieldb R B, Bissetta A L, et al. Investigation of outbreaks of highly pathogenic H5N1 avian influenza in waterfowl and wild birds in HONG KONG in late 2002[J]. Avian Pathol,2004(335):492-505.

[3]Chen H, Smith D G, Zhang S Y, et al. Avian flu: H5N1 virus outbreak in migratory waterfowl[J]. Nature,2005(436):191-192.

[4]Arzey G. The role of wild aquatic birds in the epidemiology of avian influenza in Australia[J]. Aust Vet J,2004,82(6):377-378.

[5]郭亮，柴洪亮，张兰兰，等.野鸭源H3N8亚型禽流感病毒NS 基因的分子克隆及序列分析[J].东北林业大学学报，2009(7)：115-118.

[6]王湘予，杨文林，张彦明.青海湖地区野禽禽流感监测与分析[J].动物医学进展，2009，(7)：20-22.

[7]赵全邦，马睿麟，蔡金山，等.青海湖地区野(候)鸟禽流感流行病学监测[J].中国动物检疫，2008,25(11)：39-40.

[8]范仲鑫，刘道新，唐小明，等.野生鸟类禽流感病毒感染情况的调查[J].中国预防兽医学报，2012,34(2)：96-99.

[9]孙泉云，王天厚，刘佩红，等.上海地区野鸟中禽流感的流行病学监测[J]．动物医学进展，2007，(6)：19-23.

[10]朱曦，陈勤娟，詹伟君，等. 杭州市鸟类区系研究[J].浙江林学院学报,2002，19(1)：36-47.

收稿日期：2015-12-15

作者简介：龚利洋(1980-)，男，浙江上虞人，兽医师，硕士，主要从事野生动物疾病防治工作。E-mail:lygong2004@aliyun.com

中图分类号：S858.9

文献标识码：A

文章编号：1005-7307(2016)03-0006-003