血管紧张素(1-7)对氧化低密度脂蛋白诱导大鼠主动脉内皮细胞损伤的作用机制

杜宁辉，杨志明，杨慧宇

山西医科大学附属第二临床医学院(太原 030001)



血管紧张素(1-7)对氧化低密度脂蛋白诱导大鼠主动脉内皮细胞损伤的作用机制

杜宁辉，杨志明，杨慧宇

山西医科大学附属第二临床医学院(太原 030001)

摘要：目的观察血管紧张素(1-7)[Ang(1-7)]对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的大鼠主动脉内皮细胞(SVAREC)血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达水平的影响，探讨其可能作用机制。方法将大鼠随机分为ox-LDL组和ox-LDL+Ang(1-7)组。实验通过Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)检测细胞增殖情况。通过荧光实时定量PCR法检测LOX-1、VCAM-1、ICAM-1mRNA的表达水平。结果ox-LDL可以抑制SVAREC细胞的增殖，并呈剂量依赖性，与对照组比较有统计学意义(P<0.05)。ox-LDL+Ang(1-7)组可以使SVAREC细胞生长抑制率降低，并呈剂量依赖性，与对照组比较有统计学意义(P<0.05)。随着ox-LDL浓度的升高，LOX-1、ICAM-1及VCAM-1 mRNA表达量上升，并呈剂量依赖性，与对照组比较有统计学意义(P<0.05)，加入Ang(1-7)，随着Ang(1-7)的浓度升高，LOX-1、ICAM-1及VCAM-1mRNA表达量下降。结论ox-LDL可以损伤SVAREC细胞，并使LOX-1、ICAM-1及VCAM-1mRNA表达量上升，Ang(1-7)抑制ox-LDL的上述反应，并且可能通过LOX-1、ICAM-1及VCAM-1mRNA发挥作用。

关键词：血管紧张素 (1-7)；氧化低密度脂蛋白；氧化低密度脂蛋白受体1；主动脉内皮细胞；血管细胞黏附分子-1；细胞间黏附分子-1

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是许多心血管疾病的病理基础，目前公认血管内皮细胞的损伤和功能障碍是AS发生和发展的始动因素和中心环节之一。血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1(lectin like oxidized low-density lipoprotein receptor 1，LOX-1)是近年发现的新型氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)特异受体，是内皮细胞摄取和代谢ox-LDL的主要受体，其介导血管内皮细胞摄取ox-LDL并引起内皮损伤及功能改变[1-2]。血管紧张素(1-7)[Ang(1-7)]具有降血压，保护心肌细胞等作用[3]。细胞间黏附分子-1(ICAM-1)又称 CD54，是目前已知的最广泛的细胞间黏附分子，正常情况下它呈现低表达状态，某些炎症刺激后其表达明显增加。ICAM-1广泛分布于血管内皮细胞、树突状细胞、各类上皮细胞、激活的淋巴细胞、巨噬细胞和纤维母细胞等表面，不但参与炎症反应、诱导新生血管生成、免疫反应，而且与动脉粥样硬化的形成等有关[4]。血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)是免疫球蛋白超基因家族，主要由血管内皮组胞表达，在高血脂刺激AS形成过程中，能促进免疫细胞浸润，使单核细胞和淋巴细胞黏附于血管内皮[5]。本实验观察Ang(1-7)对ox-LDL诱导大鼠主动脉内皮细胞(SVAREC)LOX-1、ICAM-1、VCAM-1的表达水平的影响，探讨其可能作用机制。

1材料与方法

1.1材料与试剂大鼠主动脉内皮细胞SVAREC(上海沪震生物科技公司)；Ang(1-7)、ox-LDL购自美国Sigma公司；胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司；DMEM培养液为美国Gibco公司产品；CCK-8为美国Sigma公司产品；TrizolRNA提取试剂、反转录试剂盒、FastStart Universal SYBR Green Mastel(ROX)试剂盒均为罗氏公司产品；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；酶标仪为美国Becton Dickinson公司产品。

1.2大鼠内皮细胞的培养大鼠内皮细胞SVAREC悬浮于含20%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM培养基中，置于体积分数5% CO2培养箱中37 ℃保存，用0.25%胰蛋白酶进行消化、传代。取2代～3代细胞进行试验，给予干预措施时培养液改为含3%胎牛血清的DMEM。

1.3实验分组① ox-LDL组，分为空白对照组及实验组(ox-LDL浓度分别为10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)；②ox-LDL+Ang(1-7)组，分为对照组(ox-LDL终浓度为100 mg/L)及实验组[(Ang(1-7)浓度分别为10-9mol/L～10-6mol/L)]。

1.4CCK-8法检测大鼠细胞增殖情况收集2代～3代SVAREC细胞处于对数生长期的细胞消化、重悬、计数，以5×104/mL密度每孔100 μL，接种细胞至96孔板。对照孔加入不含药物的新鲜培养液100 μL，给药组每孔加入不同浓度的含药培养液100 μL，设5个复孔，于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养24 h，每孔加入CCK-8试剂10 μL，于CO2培养箱中孵育1 h后，用酶标仪于450 nm波长下测定吸光度值，采用双波长进行测定吸光度值(A值)。按照公式计算细胞的生长抑制率，上述实验重复3次后取平均值，用SPSS17.0软件计算。 细胞生长抑制率=(1-实验组的平均A值/阴性对照组的平均A值)×100%

1.5实时定量PCR检测LOX-1、ICAM-1、VCAM-1 mRNA收集经ox-LDL组、ox-LDL+Ang(1-7)组处理24 h的细胞，用TRIzol试剂提取总RNA，采用紫外可见光分光光度计测定260 nm/280 nm OD值，测定RNA纯度。以Ol-igo dT为引物，按照逆转录试剂盒说明书进行操作，得到对应的cDNA，置于-20 ℃保存备用。以cDNA为模板LOX-1、ICAM-1、

VCAM-1引物进行扩增，用GAPDH做内参照。LOX-1上游引物5′-ACCACCAGAATCTGAATCTCCAA-3′，下游引物5′-TTGCGGACAAGGAGCTGAAC-3′，扩增片段长度为68 bp；ICAM-1上游引物5′-AAACGGGAGATGAATGGT-3′，下游引物5′-TCTGGCGGTAATAGGTGTA-3′，扩增片段长度为184bp；VCAM-1上游引物5′-CCCTTGACCGGCTGGAGATT-3′，下游引物5′-CTGGGGGCAACATTGACATAAAGTG-3′，扩增片段长度为241 bp；GAPDH上游引物5-′CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3′，下游引物5′-TAAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3′，扩增片段长度为151 bp。反应条件设定：94 ℃预变性10 min；然后94 ℃15 s，60 ℃ 60 s，45个循环结束。溶解程序：95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s，然后RT-PCR SYBR Green检测。处理组均设3个复管，取其CT值的均值。CT值代表反应管内荧光信号达到预设域值时所经历的循环数，2-△△CT代表初始cDNA的相对量。

2结果

2.1CCK-8法检测大鼠细胞增殖情况不同浓度ox-LDL(10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)作用于SVAREC细胞24 h后，SVAREC细胞随着ox-LDL浓度升高，细胞生长抑制率升高，呈剂量依赖性，在相同时间下，与对照组比较，不同浓度的ox-LDL组间差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1、图1。ox-LDL在终浓度为100 mg/L基础上，分别加入不同浓度的Ang(1-7)(10-9mol/L～10-6mol/L)作用细胞24 h后，随着Ang(1-7)浓度升高，细胞生长抑制率升高，呈剂量依赖性，不同浓度的ox-LDL组间差异有统计学差异(P<0.05)。详见表2、图2。

表1　不同浓度ox-LDL作用细胞24 h细胞增殖情况(±s)

图1　不同浓度ox-LDL作用细胞24 h细胞增殖情况

组别剂量生长抑制率(%)对照组oxLDL(100mg/L)28.30±0.73实验组oxLDL+Ang(17)(10-9mol/L)22.55±0.821)oxLDL+Ang(17)(10-8mol/L)18.29±0.691)oxLDL+Ang(17)(10-7mol/L)13.23±0.601)oxLDL+Ang(17)(10-6mol/L)9.47±1.011) 与对照组比较,1)P<0.05。

注：1.ox-LDL；2.ox-LDL+Ang(1-7)(10-9mol/L)；3.ox-LDL+Ang(1-7)(10-8mol/L)；4.ox-LDL+Ang(1-7)(10-7mol/L)；5.ox-LDL+Ang(1-7)(10-6mol/L)

图2不同浓度Ang(1-7)作用细胞24 h细胞增殖情况

2.2实时定量PCR检测LOX-1、ICAM-1、VCAM-1 mRNA SVAREC细胞经ox-LDL组(10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)和ox-LDL(100 mg/L)+Ang(1-7)(10-9mol/L～10-6mol/L)组处理24 h后，用Real-time PCR检测基因LOX-1、ICAM-1、VCAM-1mRNA的表达水平。溶解曲线分析结果显示LOX-1、ICAM-1、VCAM-1mRNA引物均可以扩增出单一的产物，且未出现其他明显异常的波形，波形锐利，提示特异性较好(见图3～图5)。ox-LDL组处理SVAREC细胞24 h后，LOX-1、ICAM-1及VCAM-1

mRNA表达量上升，与同时间对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)(见表3)。ox-LDL(100 mg/L)+Ang(1-7)(10-9mol/L～10-6mol/L)组处理24 h后，Ang(1-7)抑制ox-LDL的上述反应，LOX-1、ICAM-1及VCAM-1mRNA表达量下降(见表4)。

图3　 LOX-1溶解曲线

图4　ICAM-1溶解曲线

图5　VCAM-1溶解曲线

表3　 ox-LDL组作用SVAREC细胞24 h基因表达水平(±s)

表4　ox-LDL(100 mg/L)+Ang(1-7)组处理SVAREC细胞24 h基因表达量(±s)

3讨论

动脉粥样硬化的发生机制十分复杂，但目前公认内皮细胞的损伤和功能障碍是AS发生的始动因素和中心环节。血管内皮受多种因素的影响，尤其是氧化低密度脂蛋白、肾素-血管紧张素系统、氧化应激、同型半胱氨酸等。近年来，愈来愈多的研究提示ox-LDL诱发的内皮功能障碍加速AS的形成，增加了心肌缺血再灌注损伤和急性心肌梗死，成为目前心血管疾病领域的一个研究热点。

LOX-1是主要存在于血管内皮细胞上的ox-LDL特异受体。在氧化应激的作用下，形成了比LDL具有更高细胞毒性的ox-LDL，与内皮细胞表面的受体LOX-1特异性结合后，经过内吞作用而损伤细胞，导致其内皮功能失调，使血管内皮细胞(VEC)生成一氧化氮合酶(NOS)减少，分泌的NO量减少，血管收缩，血小板和白细胞在内膜损伤处黏附、聚集和启动，VSMC增殖和内膜异常增生。VEC受损后，脆性增加，渗透性和黏附性增强，大量LDL进入内膜下沉积，经氧化形成ox-LDL，导致恶性循环。研究发现，内皮细胞与ox-LDL一起培养24 h后，内皮细胞参与构成细胞骨架微丝的破坏、断裂，这一作用导致内皮细胞间隙增大，通透性增加，有利于脂粒分子穿过内皮层进入内皮下，这也是导致AS形成机制之一。ox-LDL可通过降低内皮合成和释放NO使AS中内皮细胞对凋亡敏感。LOX-1的激活与内皮细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞的凋亡均有关系，此过程是导致斑块不稳定和急性冠脉综合征发生的重要机制之一[6]。已有研究认为，ox-LDL与VEC间的是通过受体介导的。日本学者Swamura等1997年首先于牛主动脉内皮细胞上发现了LOX-1，它主要表达在及血管丰富组织的ox-LDL特异受体。在生理条件下LOX-1可以结合或吞噬已凋亡的细胞或者细菌等，发挥清道夫受体的功能；而在病理条件下，促炎因子、氧化应激、NO缺乏、流体剪切应力等多种刺激都可以诱导LOX-1介导内皮细胞对ox-LDL的吞纳、降解及损伤作用[7]。

肾素-血管紧张素系统的过度激活在心血管病的发生、发展过程中有着十分重要的作用。目前研究发现Ang(1-7)具有扩张血管、降低血压作用，抗血管再狭窄作用、抑制平滑肌细胞增殖，抗心肌肥厚、抑制心肌细胞肥大的作用，减轻心肌再灌流损伤和改善心肌梗死后心室重构，抗增殖以及利钠、利尿，调节水、盐及电解质平衡等作用。Loot等[8]对心力衰竭大鼠持续注射Ang(1-7)后发现，8周后就可以改善主动脉内皮功能，明显增加了冠状动脉血流量改善心脏功能。目前大量的循证医学证明，ACEI具有保护血管内皮功能和心肌功能的作用，已经成为了治疗心血管病的重要手段，它的作用可能是通过Ang(1-7)来实现，提示Ang(1-7)具有心肌和血管内皮的保护作用[9-10]。

本研究采用CCK-8和实时定量RT-PCR法从细胞和基因水平，观察Ang(1-7)对ox-LDL诱导的大鼠主动脉内皮细胞LOX-1mRNA表达的影响。研究结果显示随着ox-LDL浓度的升高，ox-LDL可以呈剂量依赖性抑制SVAREC细胞的增殖，LOX-1、ICAM-1及VCAM-1mRNA表达量上升，并呈剂量依赖性，给予不同浓度的Ang(1-7)干预后，随着Ang(1-7)的浓度升高，LOX-1、ICAM-1及VCAM-1mRNA表达量下降。本实验从细胞和基因水平分别证实，Ang(1-7)可抑制内皮细胞LOX-1的表达，从而对内皮细胞可能起到保护作用。

本研究结果表明Ang(1-7)可抑制ox-LDL，从而显示出其对血管内皮细胞可能具有保护作用，然而具体的作用机制有待进一步研究。

参考文献：

[1]朱惠莲，侯孟君，李燕，等.氧化型低密度脂蛋白经血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1途径诱导血管内皮细胞损伤[J].中国动脉硬化杂志，2004，12(4)：383-386.

[2]Li DY，Zhang YC，Philipe I，et al.Upregulation of endothelial receptor for oxidized low-density lipoprotein (LOX-1) in cultured human artery endothelial cells by angiotensin Ⅱ type receptor activation[J].Circ Res，1999，84(9)：1043-1049.

[3]Kucharewicr I，Pawlak R，Matys T，et al.Angiotensin(1-7)：an active member of the rennin-angiotensin system[J].J Physiol Pharmacol，2002，53：533-540.

[4]Greenwood J，Heasman SJ，Alvarez JI，et al.Review： leucocyte-endothelial cell crosstalk at the blood-brain barrier： a prerequisite for successful immune cell entry to the brain [J].Neuropathology and Applied Neurobiology，2011，37(1)：24-39.

[5]Mestas J，Ley K.Monocyte-endothelial cell interactions in the development of atherosclerosis[J].Trends Cardiovasc Med，2008，18：228-232.

[6]Grelli S，Spitalieri P，Filesi I，et al.Invivo and invitro studies support that a new splicing isoform of OLR1 gene is protective against acute myocardial infarction [J].Circ Res，2005，97(2)：152-158.

[7]Sakurai K，Sawamura T.Stress and vascular response： endothelial dysfunction via lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1： close relationships with oxidative stress [J].J Pharmacol Sci，2003，91(3)：182-186.

[8]Loot AE，Roks AJM，Henning RH，et al.Angiotensin1-7(1-7) attenuates the development of heart failure after myocardial infarction in rats [J].Circulation，2002，105(13)： 1548-1550.

[9]马虹.血管紧张素(1-7)的心血管调节作用[J].中华心血管杂志，2004，32(6)：32-36.

[10]边云飞，杨慧宇，杨志明.氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞Fraetalkine表达的影响及机制分析[J].中国动脉硬化杂志，2009，17(10)：802-807.

(本文编辑薛妮)

Mechanisms of Angiotensin(1-7) on Aortic Endothelial Cell Injury Induced by Oxidized Low Density Lipoprotein in Rats

Du Ninghui，Yang Zhiming，Yang Huiyu

The Second Affiliated Clinical College，ShanXi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China

Abstract：Objective To investigate the effects of angiotensin (1-7) [Ang (1-7)] on expression levels of lectin like oxidized low-density lipoprotein receptor 1 (LOX-1)， intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1) in SV40-transformed aortic rat endothelial cells (SVAREC) induced by oxidized low density lipoprotein(ox-LDL)， and to explore its possible mechanism.MethodsCultured endothelial cells of rats were randomly divided into ox-LDL group and the ox-LDL+Ang-(1-7) group.The cell proliferation was detected by experimental Cell Counting Kit (CCK 8).The expression levels of LOX-1， ICAM-1， VCAM-1 mRNA were detected by fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) method.ResultsOx-LDL could inhibit SVAREC cell proliferation in a dose-dependent manner， and there was statistically significant compared with the control group (P<0.05).Compared with control group，SVAREC cell growth inhibition rate was reduced in Ox-LDL+Ang(1-7) group.With the increase of ox-LDL concentration， LOX-1， ICAM-1 and VCAM-1 mRNA expression increased， and in a dose-dependent manner， and there was statistically significant compared with the control group(P<0.05).With the increase of Ang(1-7)， LOX-1， ICAM-1 and VCAM-1 mRNA expression decreased in Ox-LDL+Ang(1-7) group.ConclusionSVAREC ox-LDL can damage cells and LOX-1， ICAM-1 and increased VCAM-1mRNA expression and Ang(1-7) inhibition of ox-LDL of the reaction， and through the LOX-1， ICAM-1 and VCAM-1mRNA play a role.

Key words：angiotensin-(1-7)；oxidized low density lipoprotein； lectin like oxidized low-density lipoprotein receptor 1； SV40-transformed aortic rat endothelial cells； vascular cell adhesion molecule-1； intercellular adhesion molecule-1

通讯作者：杨志明，E-mail： duyu56@126.com

中图分类号：R543.5R256.2.

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．08．011

文章编号：1672-1349(2016)08-0833-05

Corresponding Author：Yang Zhiming

(收稿日期：2015-09-12)