循环miR-92a在稳定型冠心病合并2型糖尿病血瘀证中的表达

崔亚萌，王文一，王小飞

1.天津市中医药大学(天津 300073)；2.天津市第一中心医院



循环miR-92a在稳定型冠心病合并2型糖尿病血瘀证中的表达

崔亚萌1，王文一2，王小飞2

1.天津市中医药大学(天津 300073)；2.天津市第一中心医院

摘要：目的观察稳定型冠心病合并2型糖尿病血瘀证及非血瘀证病人循环血清miR-92a的表达情况及临床意义。方法选择2014年10月—2015年6月住院治疗的稳定型冠心病合并糖尿病病人60例，按照冠心病血瘀证诊断标准共纳入血瘀证组病人30例。非血瘀证组病人30例，另纳入17名健康受试者作为对照组。对3组研究对象外周血清进行茎环实时荧光定量(RT-qPCR)分析，比较miR-92a表达情况，收集病人年龄、性别、体重指数(BMI)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、糖化血红蛋白(HbA1c)、纤维蛋白原(FIB)，并作出相关性分析。结果与健康对照组相比，稳定型冠心病合并糖尿病血瘀证组、非血瘀证组miR-92a水平均较正常组升高，差异有统计学意义(P<0.05)，且血瘀证组较非血瘀证组明显升高。血瘀证组与健康对照组LDL-C、FIB、HbA1c比较差异具有统计学意义(P<0.05)。多因素相关分析显示miR-92a表达量与FIB、血瘀证积分存在正相关性。结论循环miR-92a在稳定型冠心病合并糖尿病血瘀证中明显升高，有可能作为早期诊断冠心病合并2型糖尿病血瘀证的客观生物指标之一。

关键词：冠心病；2型糖尿病；血瘀证；miR-92a；胸痹；心悸；消渴

冠心病合并糖尿病对血管内皮的损伤是近年来心血管领域研究的热点之一，两种疾病的叠加效应可以加速血管内皮的炎性损伤，加快动脉粥样硬化的进程，增加心脑血管疾病的病死率[1]。中医古籍并无冠心病、糖尿病病名，中医内科学将冠心病归属于“胸痹”“真心痛”“心悸”范畴，糖尿病分属于“消渴”范畴。近年来随着冠心病合并糖尿病患病率的不断上升，部分中医提出“糖心病”“胸痹消渴”等病名，并结合客观影像资料、检验指标等试图制订规范化的诊断标准。基于中医“异病同治”的哲学思想及临床文献报道，冠心病合并糖尿病总体以本虚标实为主，虚以气虚、阴虚为主，实则以血瘀、痰浊等病理产物为主，其中血瘀证在冠心病合并糖尿病的中医证型中占大多数，且具有独特的冠脉病变特点，即病变弥漫、狭窄较重，多支血管病变显著高于冠心病无糖尿病者。MicroRNA(miRNA)是一种非编码单股小RNA，能够在反转录水平调节基因表达，目前在动脉管壁和血管内皮细胞中发现约40种miRNAs高表达，这些miRNAs对调节血管的发育、创伤修复、氧化还原信号、炎症应答、血管再生起着重要作用，其中miR-92a是首个在体内体外试验中被证实通过抑制信号通路MKK4-JNK1增加血管内皮的增殖和迁移，减少球囊和支架对血管损伤后新生内膜的形成，进而降低血管内支架再狭窄的发生率[1-2]。

本研究通过检测外周血miR-92a在冠心病合并糖尿病血瘀证中的表达，明确其表达情况，以期建立冠心病合并2型糖尿病血瘀证与循环miR-92a的关系，为早期发现血管损伤，防治动脉粥样硬化提供新的生物标记物。

1资料与方法

1.1一般资料选择2014年10月—2015年6月住院治疗诊断为慢性稳定型冠心病合并2型糖尿病病人60例，男39例(65%)，女21例(35%)。按照相关诊断标准分为血瘀证组30例，男21例，女9例，64.73岁±8.22岁；非血瘀证组30例，男18例，女12例，年龄63.70岁±6.58岁。另选正常对照组17名，年龄64.29岁±3.77岁。病人既往诊断有高血压病29例(48%)，脑卒中6例(10%)，高脂血症27例(45%)。两组病人年龄、性别等比较差异无统计学意义。

1.2纳入标准慢性稳定型冠心病诊断标准：①临床表现为无心绞痛症状的冠心病病人，或2个月内心绞痛发作持续时间、性质、诱因、频率或缓解方式无明显变化；②1月内无急性心肌梗死或及行冠脉综合征，和(或)③EKG 具有缺血的ST段变化和(或) T波变化，和(或) ④冠脉CT/造影下冠脉狭窄>50%。

T2DM诊断标准：①空腹血糖(FPG)≥126 mg/dL(7.0 mmol/L)；②OGTT试验，餐后2 h血糖≥200 mg/dL(11.1 mmol/L)；③具有典型症状的高血糖症或高血糖风险，并且随机血糖≥200 mg/dL(11.1 mmol/L)(2次以上)；④糖化血红蛋白≥6.5%。血瘀证诊断标准：结合1986年广州全国活血化瘀学术会议制定的血瘀证诊断标准[3]，血瘀证积分参考付长庚等[4]制定的冠心病血瘀证诊断标准。

1.3排除标准①1型糖尿病、酮症、昏迷状态；②恶性肿瘤、血液系统疾病、免疫系统疾病；③急性炎症、出血、妊娠；④严重肝肾功能不全、精神心理障碍。本研究经医院伦理委员会同意，病人及家属签署知情同意书。

1.4样本采集与处理研究对象均于入院次日晨抽取外周静脉血2 mL于促凝管中，3 000 r/min离心15 min，取上层血清分装于无酶EP管中，-80 ℃冻存备用。 采集研究对象的一般资料：包括年龄、性别、体重指数(BMI)、瘀血症状体征(包括舌象、脉象，并予评分)、血脂、糖化血红蛋白、纤维蛋白原等。 数据分析：通过茎环RT-PCR(stem loop real time polymerase chain reaction)测定研究对象血清miRNA相应CT值，在外参与目的基因扩增效率一致的前提下，表达差异比较采用2-ΔΔCT法。其中miRNA的表达量=2-ΔΔCT。

1.5实验试剂与仪器

1.5.1试剂Trizol，氯仿，异丙醇，无水乙醇，DEPC水，Takara逆转录试剂盒(047A)，Takara荧光定量PCR试剂盒(820A)，引物miR-cel-39，miR-92a(广州锐博生物科技有限公司)。

1.5.2仪器高速低温离心机、PCR仪(德国eppendorf公司)、7300荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.6茎环RT-PCR

1.6.1总RNA提取 Trizol加入到200 μL血清中分离总RNA，反复锤打变性后，加入浓度为25 fmol～30 fmol的miR-cel-39，后加入氯仿抽提，剧烈震荡，静置5 min，室温离心12 000 r/min，10 min，小心吸取上清500 μL转移至1.5 mL EP管中，加入等体积异丙醇混匀-20 ℃沉淀过夜，后倾倒上层，75%无水乙醇DEPC洗涤，4 ℃离心12 000 r/min，5 min，倾倒上层，倒置于干净滤纸上晾干RNA 2 min～3 min，取15 μL DEPC水溶解RNA，于分光光度计检测RNA浓度及质量，记录后-80 ℃冻存。

1.6.2逆转录反应按照试剂盒在冰上配制反应液，其中RT-primer由miR-cel-39 RT-primer、miR-92a RT-primer代替，目的外参与目的基因分管进行，反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃放置。

1.6.3茎环RT-PCR按照荧光定量试剂盒配制反应液，其中Forward Primer、Reverse Primer由特异引物代替，反应条件：90 ℃ 30 s 预变性；95 ℃ 5 s 变性，60 ℃ 31 s 退火、延伸，重复40个循环，70 ℃～95 ℃绘制溶解曲线。每个样本设3个复孔，反应重复3次分别取平均值。所得CT值即表示每个反应管内的荧光信号达到设定阈值所经历的循环数。。

2结果

2.13组研究对象临床资料比较3组年龄、性别具有可比性，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1　3组临床资料比较

2.2各组循环miR-92a的方差分析miR-92a表达水平在血瘀证组中表达最高，其次为非血瘀证组，在健康对照组中表达最低，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，其中血瘀证组与健康对照组之间比较差异有统计学意义(P<0.01)。详见表2、图1。

表2　各组miR-92a水平比较(2-ΔΔCT法)

图1　 各组miR-92a表达水平比较(#：与健康组比

2.3血瘀证积分与miR-92a的相关性分析与健康对照组比较，非血瘀证组和血瘀证组低密度脂蛋白胆固醇、纤维蛋白原、糖化血红蛋白(HbA1c)均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。采用多元回归分析，血瘀证组miR-92a的表达量与FIB、血瘀证积分呈正相关，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3，图2。

表3　各组miR-92a表达水平与FIB、血瘀证积分线性相关分析

图2　血瘀组miR-92a表达水平与FIB、血瘀证积分呈正相关

3讨论

近年来，大量研究证实冠心病与血瘀证存在密切联系，通过冠脉造影发现血瘀证与冠脉病变程度、病变范围呈正相关，且血瘀证积分越高，相关性越明显[5]。作为其病理产物之一，血瘀证参与冠心病的主要病理环节，包括血小板活化、血栓形成、血管狭窄、痉挛，最终导致血管内皮结构与功能的损伤；而冠心病合并T2DM病人，长期高血糖状态通过各种途径加重氧化应激，加剧血管内皮的损伤。目前已知MiR-92a在主动脉内皮细胞和血管内皮高表达，Wu等[6]发现在人脐静脉血管内皮细胞中MiR-92a过表达可抑制调控转录因子KLF2的表达，其作为调节内皮系统发育和血管功能的关键因子，在mRNA水平及蛋白质水平调控一氧化氮合酶(eNOS)和血栓调节蛋白(TM)，表明miR-92a可能在动脉粥样硬化早期内皮损伤的机制中起着重要调控作用。研究证实冠心病合并T2DM较单纯冠心病病人循环miR-92a表达上调，提示miR-92a表达与血管内皮损伤和功能障碍相关。本研究验证了稳定型冠心病合并2型糖尿病血瘀证组miR-92a较正常组表达升高的基础上得出血瘀证与非血瘀证miR-92a表达存在差异，表明冠心病合并T2DM血瘀证循环miR-92a较非血瘀证表达升高，且随着血瘀证积分的增高，miR-92a表达明显升高。 本研究相关性分析提示冠心病合并2型糖尿病血瘀证病人循环miR-92a表达量与FIB呈负相关，与冠心病血瘀证积分呈正相关。冠心病合并糖尿病病人多存在代谢紊乱，糖类、脂类代谢的异常造成血管内皮缺氧，氧自由基、炎性因子大量释放，导致细胞黏附、聚集；巨噬细胞吞噬低密度脂蛋白形成脂质斑块，造成内皮损伤。刘芬等[7]通过培养人微血管内皮细胞模型证实缺氧后可诱导miR-92a、miR-210表达上调，进而刺激新生血管，与其相关的信号分子血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达亦升高。另外FIB水平、年龄、吸烟、体重指数都是其危险因素。

本研究的特点之一是将血瘀证与冠心病、2型糖尿病结合，与临床紧密结合，利于中西医病证结合；另一特点为采用茎环引物实时定量PCR检测循环miR-92a。茎环实时定量PCR是目前公认的灵敏度、特异性均较其他方法显著的检测微小RNA的方法，采用基因特异的茎环引物[8]，既可增强RNA-DNA杂化双链的热稳定性，又能增强茎环引物所产生的空间约束，但此方法成本较高，不适于大样本研究。本研究是基于茎环引物逆转录和SYBR Green qPCR检测法，不仅可通过溶解曲线判断PCR反应的特异性，且克服了常规SYBR Green qPCR灵敏度、特异性低的特点，降低成本。

本研究采用改进的SYBR Green qPCR方法研究冠心病合并2型糖尿病血瘀证、非血瘀证病人及健康人血样miR-92a的表达，并分析miR-92a与FIB血瘀证积分之间的相关性，以期为早期中西医结合预防治疗冠心病合并糖尿病提供依据。不足之处在于样本量较小，且关于miR-92a与下游炎性通路相关炎性因子之间的关系也有待进一步阐述。

参考文献：

[1] Manni I，Artuso S，Careccia S，et al.The microRNA miR-92 increases proliferation of myeloid cells and by targeting p63 modulates the abundance of its isoforms[J].Faseb Journal，2009，23(11):3957-3966.

[2]Zhang L，Zhou M，Wang Y，et al.miR-92a inhibits vascular smooth muscle cell apoptosis：role of the MKK4-JNK pathway[J].Apoptosis，2014，19(6):975-983.

[3] 中国中西医结合学会活血化瘀专业委员会.血瘀证诊断标准[J].中西医结合杂志，1987，7(3):129.

[4] 付长庚，高铸烨，王培利，等.冠心病血瘀证诊断标准研究[J].中国中西医结合杂志，2012，32(9)：1285-1286.

[5] 鞠镐，程文立，柯元南，等.冠心病心绞痛病人冠状动脉造影与中医辨证分型关系的研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2005，3(7):569-571.

[6]Wu W，Xiao H，Laguna-Fernandez A，et al.Flow-dependent regulation of kruppel-like factor 2 is mediated by microRNA-92a [J].Circulation，2011，124(5):633-641.

[7] 刘芬，娄远蕾，阮琼芳，等.内皮细胞缺氧后miR-210、miR-92a、miR-126表达及意义[J].山东医药，2011，51(39):4-5.

[8] 薛慧慧，马骁骁，朱长保，等.改进茎环引物RT-PCR法实时定量检测microRNA.现代生物医学进展，2014，14(28)：5431-5435.

(本文编辑 薛妮)

基金项目：天津市卫生局面上项目(No.2014KY13)

通讯作者：王文一，E-mail：6726392cuicui@sina.com

中图分类号：R541.6R289.5

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．08．007

文章编号：1672-1349(2016)08-0817-04

(收稿日期：2015-10-27)