用cre-loxp鼠研究Runx2在釉质发育中的作用

徐海春，王 伟，徐晓东▲

（1上海市黄浦区半淞园社区卫生服务中心口腔科, 上海 200011；2.上海市同仁医院口腔科, 上海 200336）

用cre-loxp鼠研究Runx2在釉质发育中的作用

徐海春1，王 伟2，徐晓东2▲

（1上海市黄浦区半淞园社区卫生服务中心口腔科, 上海 200011；2.上海市同仁医院口腔科, 上海 200336）

目的 为研究Runx2基因缺失对牙釉质发育的影响，拟建立Runx2基因条件性敲除的小鼠动物模型。方法 利用染色体位点特异性重组酶cre-loxp系统和FLP-frt的条件性基因打靶，借助于同源重组将两个同向的loxp位点置于Runx2基因的编码重要功能域外显子2两侧的内含子序列中，从而获得表型正常的Flox小鼠，为了提高ES细胞筛选的效率，插入被FRT位点瞄定的、作为选择性筛选的阳性标记neo基因，同时插入作为负性筛选的DTA，通过电转的方式，将构建成功的载体电导入到ES细胞，并通过对中靶的ES细胞进行筛选和鉴定，得到了同源重组正确的阳性克隆，通过显微注射，将中靶的ES细胞导入囊胚中，将囊胚移植到代孕鼠子宫内，最终得到嵌合体小鼠，将此嵌合体小鼠与FLP工具鼠杂交，利用FRT与FLP特异性识别，去掉neo基因即可获得阳性的loxp鼠，将其与组织特异性表达cre重组酶的转基因小鼠杂交，特异性表达的cre重组酶将介导loxp位点间的基因片段重组。小鼠出生后经PCR鉴别，获得Runx2基因条件性敲除的杂合子小鼠，条件性敲除的杂合子小鼠自交或与loxp纯合子小鼠杂交，小鼠出生后，PCR鉴别筛选条件性完全敲除的小鼠。RT-PCR法检测外源性Cre基因的表达。结果 构建了cre鼠、loxp鼠和Runx2基因条件性敲除的小鼠模型。结论 利用染色体位点特异性重组酶loxp-cre系统和FLP-frt系统可以很好的研究Runx2基因缺失对牙釉质发育的影响。

cre-loxp系统；Runx2；基因打靶；同源重组；FLP-frt系统

牙釉质对牙齿的生理功能具有重要的意义。牙釉质发育离不开各种转录因子的作用。Runx2作为成骨细胞分化的特异性转录因子，在牙胚发育中具有重要作用，参与牙齿萌出时的牙槽骨改建过程，对牙周膜起重要作用[1]。有文献表明[2]，Runx2可通过介导TGF-β1来调节成釉细胞基质金属蛋白酶基因（MMP20）的表达。为了进一步研究Runx2在牙釉质发育中的作用，我们利用染色体位点特异性重组酶cre-loxp系统，构建了Runx2基因条件性敲除的小鼠动物模型，为以后研究Runx2基因介导TGF-β1调控釉质的发育奠定了基础。

1 材 料 与 方 法

1.1 实验动物和仪器设备、主要材料

C57BL/6背景的小鼠（广州赛业）PCR仪（Bio-RAD7100）电泳仪（北京君意JY200C）凝胶成像系统（北京赛智CHampGe15500）2×Easy Taq PCR Super Mix（TRAN，北京全式金） RNAiso Plus（TaKaRa，大连宝生物）Agarose-Molecular Biology Grade（invitrogen75510-019， 美国）DL-500DNA Marker（TaKaRa，大连宝生物）

1.2 实验方法和步骤

1.2.1 RUNX2loxp/loxp动物模型的构建

Runx2基因位于17号染色体上，根据对其基因序列的研究，符合条件性敲除Runx2基因的条件，在其基因序列上共含7个外显子，ATG作为起始密码子，位于外显子1，TGA作为终止密码子，位于外显子7。RUNX2loxp/loxp在胚胎干细胞中通过同源重组获得，选择在编码Runx2的外显子2的两端插入两个方向相同的loxp位点。为提高ES细胞筛选效率，插入作为阳性筛选、被FRT位点瞄定的neo基因，同时插入作为负筛选标记基因DTA，载体构建成功（如图1所示）后，通过电转方式，导入到ES细胞，并通过对中靶的ES细胞进行正负双向筛选和鉴定，得到同源重组正确的阳性克隆。通过显微注射，将中靶的ES细胞导入囊胚中，将囊胚移植到代孕鼠子宫内，最终得到嵌合体flox小鼠，将此嵌合体小鼠和与FLP工具鼠杂交，利用FRT与FLP特异性识别，去掉neo基因即可获得被loxp位点瞄定的Runx2小鼠。删除两个同向loxp位点间的外显子2的序列，引起外显子2下游的移码突变，这样就获得了Runx2缺失的条件性基因敲除的小鼠动物模型。

1.2.2 pRP.ExSi-Amelogenin-cre动物模型的构建

以噬菌体P1基因组DNA为模板，用上下游引物扩增出片段长1032bp的Cre，其大小与GenBank报道的片段大小相符。以其构建的pcDNA3.1-HisACre经EcoRⅠ双酶切鉴定正确，DNA测序经BLAST显示与预期结果一致。利用GatewayTechnology构建pRP.ExSi-Amelogenin-cre启动子（如图2所示），将其经单酶切线性化后通过琼脂糖凝胶电泳（10g/ L），用QIAquick Gel ExtractionKit 回收产物，然后把其溶解在灭菌的 5 mmol /L Tris，pH7.4，0.2 mmol /L EDTA显微注射DNA 缓冲液中; 最后把线性化DNA 通过原核注射的方式注射于400个受精卵; 显微注射后的受精卵回送10只C57BL/6代孕母鼠输卵管中，受孕后出生小鼠经PCR鉴定后，即可得到转基因小鼠。

1.2.3 基因敲除小鼠的构建

由于Cre重组酶能特异性的识别loxp位点，将组织特异性Cre小鼠与去掉FRT位点的loxp鼠杂交，特异性表达的cre重组酶介导loxp位点间的基因片段重组，根据孟德尔遗传定律，cre杂合子小鼠与Flox纯合子小鼠杂交，小鼠出生后，经PCR鉴定，即可获得Runx2条件性敲除的杂合子小鼠模型，利用此杂合子小鼠自交或者此杂合子小鼠和Flox纯合子小鼠杂交，根据孟德尔遗传定律，小鼠出生后，经PCR鉴别筛选loxp纯合子同时表达cre重组酶的小鼠即为所需的Runx2条件性敲除的纯合子模型。

1.2.4 PCR鉴别筛选转基因鼠

从鼠尾提取基因组DNA，通过相应的引物利用PCR仪来鉴别筛选转基因鼠。PCR反应条件：94℃5min，94℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 20s，30个循环后72℃延伸5min，1mg/50ml的琼脂糖凝胶电泳。PCR鉴别转基因鼠的特异性引物:

鉴别Loxp（图3）:

F: GGCGCCTTGTTAGAGTGGTGCCTT

R: CCTTGTGCCAGGTTAGCTGTGC

（纯合子：309bp 杂合子：248bp/309bp 野生型：248bp）

鉴别Frt和Loxp（图4）：

BZMC001_Neo_Del F: GGGGGTTTAGCACGTACAGTAGGG

BZMC001_Neo_Del R: CTCCAACTGTCCCTGTATGAACGC

（纯合子：308bp 杂合子：168bp/308bp 野生型：168bp）

鉴定Cre鼠（图5）的特异性引物：

F: CCAGCTAAACATGCTTCATCGTC

R: TGATCCTGGCAATTTCGGCTA

Internal control F：ACTCCAAGGCCACTTATCATT

Internal control R:ATTGTTACCAACTGGACGACA

目的片段：263bp，Internal control 片段:413bp)Cre鼠的鉴别只有一条目的条带，因此不能区分纯合子还是杂合子。

Runx2基因条件性敲除的小鼠鉴别筛选：利用cre重组酶表达阳性的小鼠和Flox纯合子小鼠杂交，小鼠出生后，分别利用鉴别cre鼠的引物和loxp鼠的引物来筛选，F1代筛选出Flox杂合子同时cre重组酶表达阳性的小鼠（图6），然后利用这些小鼠雌雄自交，或者再分别和Flox纯合子小鼠交配，小鼠出生后，经PCR鉴别筛选出Flox纯合子同时cre重组酶阳性的小鼠（图7），此小鼠即为我们所需的Runx2基因条件性敲除的纯合子小鼠模型。

2 RT-PCR检测外源性Cre基因在小鼠颌骨的表达

利用Trizol法提取出生5d的Cre阳性小鼠和WT鼠的下颌骨磨牙区的RNA。参考Reverse Transcriptase M-MLV逆转录1ug总RNA为cDNA。以此cDNA为模板，GAPDH作为内参，以P1：CGACCAGGTTCGTTCACTCA

P2：CAGCGTTTTCGTTCTGCCAA（184bp） 作 为引物，用RT-PCR分别检测mCre在Cre阳性小鼠和WT小鼠下颌骨的表达。聚合酶链式反应条件：94℃ 5min，94℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 20s，30个循环后72℃延伸5min，1mg/50ml的琼脂糖凝胶电泳（图8）。

3 结 果

成功构建Flox鼠和组织特异性表达的cre鼠，通过Flox鼠和组织特异性表达的cre鼠的杂交得到了Runx2条件性完全敲除的小鼠模型。

提取cre阳性小鼠和WT小鼠总RNA，利用cre特异性引物，gapdh作内参，只能在cre阳性小鼠模板中扩增出阳性条带

图1 BZMCOO1-mRunx2载体构建图谱

图2 amelx-cre基因表达载体构建图谱

图3

图4

图5 cre阳性小鼠为第15、17、19号

图6 （1）为cre阳性小鼠与loxp纯合子小鼠杂交，所生小鼠用鉴别cre鼠的引物和Internal control引物来筛选cre阳性的小鼠，其中3，4，5，7，10为cre阳性小鼠

图6 （2）为cre鼠与loxp纯合子小鼠杂交，所生小鼠用鉴别loxp的引物来筛选，均为loxp杂合子。

图7 （1）为loxp杂合子同时cre阳性的小鼠杂交所生小鼠，用鉴别cre鼠的引物筛选，阳性小鼠为1，2，3，5，6号

图7 （2）为loxp杂合子同时cre阳性的小鼠杂交所生小鼠，用鉴别loxp鼠的引物筛选，纯合子为1，3，5号，杂合子为6，7野生型为2，4号

图8 （1） cre特异性引物

图8 （2） GAPDH

4 讨 论

Runx2属于Runt家族中的成员，是一种调节成骨细胞分化的转录因子。Runx2在骨骼形成和发育中起着重要的作用。有文献表明，Runx2基因的移码突变与颅骨锁骨发育不全有密切的关系[4]。但是关于其具体的作用机制尚不清楚。Runx2基因广泛参与牙齿发育中各组织的形成和发育[5]。因此，研究Runx2基因对牙齿发育的影响机制具有重要的意义。

转基因动物模型越来越多的运用在生命科学的基础研究，为我们研究生命科学提供了重要的手段。小鼠与人类的基因序列具有高度的同源性，因此我们采用小鼠的动物模型来研究人类的生命科学现象。利用动物模型研究生命科学现象有其自身的局限性。转基因动物的胚胎致死性是影响我们实验研究的主要问题，某些重要基因的完全性敲除可引起转基因动物的胚胎致死性，限制了我们对其的进一步研究。Cre-loxp系统的发现，很好的解决了这一难题。Cre-loxp系统利用特异性的启动子启动cre重组酶在特定的时间特定的组织特异性表达，使在特定的时间空间上对特定基因研究成为了可能。Runx2在牙齿和骨骼的发育中具有重要的作用[6]。缺乏Runx2基因的小鼠在出生时就死亡，没有骨和牙齿的发育[7]。Runx2基因位于17号染色体上，根据对其基因序列的研究，符合条件性敲除Runx2基因的条件，在其基因序列上共含7个外显子，ATG作为起始密码子，位于外显子1，TGA作为终止密码子，位于外显子7。我们选择外显子2作为条件性敲除的位点，在Runx2的外显子2两端的内含子内插入两个loxp位点，从而获得表型正常的Flox小鼠，为了提高ES细胞筛选的效率，插入作为选择性筛选的阳性标记neo基因和负筛选标记基因DTA，将构建成功的载体导入到ES细胞，并通过对中靶的ES细胞进行双向筛选和鉴定，得到了同源重组正确的阳性克隆，通过显微注射，将中靶的ES细胞导入囊胚中，将囊胚移植到代孕鼠子宫内，最终得到嵌合体Flox小鼠，将此嵌合体小鼠和与FLP工具鼠杂交，利用FRT与FLP特异性识别，去掉neo基因即可获得被loxp位点瞄定的Runx2小鼠，将此小鼠与FLP工具鼠杂交，利用FRT与FLP特异性识别，去掉neo基因即可获得阳性的Flox鼠。构建amelx启动子特异性启动cre重组酶表达的转基因小鼠，通过Flox鼠纯合子和组织特异性表达的cre小鼠的杂交，建立creloxp系统，组织特异性表达的cre重组酶将介导loxp位点间的基因重组，根据孟德尔遗传学定律，小鼠出生后经PCR鉴定可获得特异性基因敲除的杂合子小鼠，利用此同窝的杂合子小鼠交配或者分别和Flox纯合子小鼠交配，小鼠出生后，经PCR鉴别筛选loxp纯合子同时cre重组酶表达阳性的小鼠即为所需纯合子条件性完全敲除的小鼠模型。通过对Runx2基因条件性完全除的小鼠模型的观察，我们可以很好的对Runx2基因对牙齿发育的影响展开更进一步的研究，对Runx2基因对牙釉质发育影响的分子机制展开更为深入的探索。

[1]胡佳艺,李琥,侯伟,等. RUNX家族蛋白在小鼠磨牙发育过程中的表达分析[J]. 口腔生物医学,2012,04:193-196.

[2]孙学玲,孙岩,张娟娟,等. Runx2介导TGF-β1调控成釉细胞MMP20基因表达的研究[J]. 牙体牙髓牙周病学杂志,2012,02:61-65.

[3]Bruderer, M., R. G. Richards, et al. (2014). "Role and regulation of RUNX2 in osteogenesis." Eur Cell Mater 28: 269-286

[4] Qi, Z., W. Yang, et al. (2014). Identification of three novel frameshift mutations in the RUNX2 gene in three sporadic Chinese cases with cleidocranial dysplasia. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi 31(4): 415-419.

[5]文军,陆群,朱庆林. runx-2基因与牙发育[J]. 国际口腔医学杂志,2008,02:164-166.

[6]Camilleri, S. and F. McDonald (2006). "Runx2 and dental development." Eur J Oral Sci 114(5): 361-373.

[7]Aberg, T., A. Cavender, et al. (2004). "Phenotypic changes in dentition of Runx2 homozygote-null mutant mice." J Histochem Cytochem 52(1): 131-139.

徐海春(1978-), 女 ,江苏南京人,本科,主治医师.

徐晓东(1974-), 男,本科,浙江鄞县人,副主任医师.