新型组合型肝肾支持系统治疗西藏小型猪急性肾衰模型的实验研究*

冯　磊,何国林,熊龙辉,傅超毅,霍小林,高　毅△

(1.南方医科大学珠江医院肝胆二科/广东省人工器官与组织工程研究中心/“器官衰竭”防治协同创新中心,广州 510282;2.中国科学院电工研究所,北京 100190)



新型组合型肝肾支持系统治疗西藏小型猪急性肾衰模型的实验研究*

冯磊1,何国林1,熊龙辉1,傅超毅1,霍小林2,高毅1△

(1.南方医科大学珠江医院肝胆二科/广东省人工器官与组织工程研究中心/“器官衰竭”防治协同创新中心,广州 510282;2.中国科学院电工研究所,北京 100190)

[摘要]目的评估新型组合型肝肾支持系统治疗西藏小型猪肾衰模型的安全性及有效性。方法将5头西藏小型猪采用结扎双侧肾动脉的方法构建肾衰模型，造模后治疗组用新型组合型肝肾支持系统进行治疗(CRRT模式)，对照组造模后不进行治疗，在治疗0、4、8 h抽取静脉血进行内毒素、生化检测及需氧菌培养厌氧菌培养，观察造模前后、治疗前后西藏小型猪的各项生化指标的变化；实验过程中每2小时记录仪器的各项压力监测指标。结果两组实验动物肾衰模型均构建成功，治疗组经过新型组合型肝肾支持系统治疗后，一般情况改善；对照组动物一般情况持续恶化。实验动物在实验过程中，心电图未出现明显异常，两组动物在0 h时生命体征差异无统计学意义(P>0.05)，其余时段治疗组心率和呼吸频率明显低于对照组(P<0.05)，而血氧饱和度和平均动脉压明显高于对照组(P<0.05)；造模前两组实验动物的生化指标差异无统计学意义(P>0.05)；造模后两组动物与造模前相比差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组经肝肾支持系统治疗后，各项生化指标明显下降，与治疗前相比，差异有统计学意义(P<0.05)；而对照组未出现明显变化。内毒素水平均低于0.5 EU/mL，动静脉端需氧、厌氧菌培养结果显示未见细菌生长。病理检查见明显的肾小管上皮肿胀、肾小管坏死。结论新型组合型肝肾支持系统用于治疗西藏小型猪肾衰模型是安全、有效的，可进一步尝试用于临床试验。

[关键词]肾功能衰竭；组合型肝肾支持系统；西藏小型猪

急性肾衰竭(简称肾衰)是全世界发病率和死亡率均较高的一种疾病，其影响人数超过13亿人，特别是在经济不发达的地区，这些地区由于缺少肾脏替代治疗的资源，死亡人数逐年上升[1]。因此，发展支持和替代肾功能的新方法具有重要意义[2]。临床上主要通过药物、血液透析及肾移植等方法治疗，由于肾源缺乏，目前主要是通过血液透析维持患者生命状态。本研究通过西藏小型猪来构建肾衰模型，并用新型组合型肝肾支持系统(又称新型生物人工肝系统，自主研发)进行治疗，以评估新型组合型肝肾支持系统治疗西藏小型猪肾衰模型的安全性及有效性。

1材料与方法

1.1材料选择5头雄性西藏小型猪[来自南方医科大学实验动物中心，合格证号为：SCXK(粤)2011-0015]，8～9个月龄，体质量40～50 kg；所需材料包括新型组合型肝肾支持系统(由南方医科大学珠江医院联合中国科学院电工研究所共同研发)、血液透析管路(自行设计)、血液透析器(费森尤斯AV600S)、一次性血液透析双腔导管(广东百合医疗)、一次性7F双腔中心静脉导管(广东百合医疗)、有创血压心电监护仪、盐酸赛拉嗪注射液(陆眠宁Ⅱ)、丙泊酚注射乳剂、注射泵等。

1.2方法

1.2.1西藏小型猪肾衰模型的构建实验前适应性喂养1周，术前禁食水12 h，自由饮水。速眠新Ⅱ肌肉注射诱导麻醉，于股动静脉处备皮、消毒、铺单，切开皮肤，暴露股动静脉，行股动静脉插管，抽血进行血生化、血常规和凝血功能检测，经股静脉持续泵入丙泊酚维持麻醉，待麻醉满意后，进行心电监护，观察实验过程中心电图、心率、呼吸频率、血氧饱和度。于颈静脉搏动处备皮、消毒、铺单，切开皮肤，逐层分离，暴露颈静脉，行颈内静脉置管用于血液透析；腹正中区域备皮消毒，用利多卡因局部浸润麻醉，切开皮肤，逐层打开腹腔，暴露膀胱，行膀胱造瘘以便于计算尿量；暴露双侧肾脏，解剖分离双侧肾动脉，结扎双侧肾动脉，消毒关腹，将模型猪放入饲养室，给予补液，静待其苏醒，并取血检测肾功能。当肌酐大于706 μmol/L或血钾大于6.5 mmol/L时开始上机进行透析治疗。

1.2.2置换液的配制将置换液配制成白袋和紫袋两袋，白袋：生理盐水3 000 mL、10% KCl 24 mL、25% MgSO46 mL、5%NaHCO3500 mL和注射用水750 mL；紫袋：生理盐水3 000 mL、5%葡萄糖溶液460 mL、5% CaCl250 mL和注射用水750 mL；所有液体均在超净台内配制，严格无菌操作，置换液配置好后，治疗过程中经不同通路同时输入血液管路。

1.2.3肾衰模型猪的上机治疗肾衰模型猪制备好后，随机将其分为治疗组(n=3)和对照组(n=2)，按CRRT模式进行管路连接，模型猪上机前所有管路以及滤器用加入12 500 U肝素钠的706代血浆进行预充，给予静脉注射地塞米松5 mg，盐酸异丙嗪注射液25 mg肌肉注射，经双腔管按0.5 mg/kg给予肝素，同时启动肝素泵，按0.05 mg·kg-1·h-1追加肝素，实时监测活化部分凝血酶时间(APTT)，根据APTT值调整肝素泵的速率，治疗结束前1 h停止追加肝素[3]。血泵流量调节为50 mL/min，弃浆泵流量调节为10 mL/min，返浆泵流量调节为5 mL/min，补液泵流量调节为5 mL/min，超滤率20%。治疗组进行CRRT模式治疗，对照组按实验组方式连接，但不加透析器和置换液，仅补充生理盐水及葡萄糖。连接压力监测器，检查各个报警装置。每头模型猪治疗8 h，每隔2小时记录1次静脉压、跨膜压，动态监测猪的动脉血压、血氧饱和度、心率、呼吸、心电图。治疗过程中，每隔2小时输入0.9%生理盐水200 mL进行冲管，以防止滤器和管路堵塞，密切注意西藏小型猪的胸廓起伏、生命体征的变化。同时从实验开始第0、4、8 h股静脉采血进行血培养、内毒素、血生化、血常规和凝血功能检测(南方医科大学珠江医院检验科)。治疗结束后，继续观察实验猪饮食、饮水、生命体征等变化[3]。

2结果

2.1一般情况所有实验猪肾衰模型均构建成功，造模过程中未出现麻醉过量、失血过多等状况，造模后西藏小型猪尿量明显减少，精神萎靡，进食减少。治疗组经过新型组合型肝肾支持系统治疗后，一般情况改善，进食增加。对照组动物一般情况持续恶化。治疗过程中机器各项监测系统正常，未出现异常状况。

2.2两组实验动物生命体征的变化实验动物在实验过程中，心电图未出现明显异常，两组实验动物在0 h时生命体征差异无统计学意义(P>0.05)，其余时段治疗组心率和呼吸频率明显低于对照组(P<0.05)，而血氧饱和度和平均动脉压明显高于对照组(P<0.05)，见表1。

2.3造模前后及治疗4、8 h后的生化指标变化造模前两组实验动物的生化指标差异无统计学意义(P>0.05)；造模后两组动物与造模前相比差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组经肝肾支持系统治疗后，各项生化指标明显下降，与治疗前相比，差异有统计学意义(P<0.05)；而对照组未出现明显变化(图1)。

2.4污染情况实验第0、4、8小时采血所测得的内毒素结果均小于0.5 EU/mL，动静脉端需氧、厌氧菌培养结果显示未见细菌生长。

2.5病理检测结果造模前肾组织中肾小球、肾小管结构清楚、正常；造模后能看见明显的肾小管上皮肿胀、肾小管坏死(图2)。

表1　实验动物生命体征的变化±s)

a:造模前；b:造模后；c:上机4 h;d:上机8 h。

图1实验动物生化指标的变化

A:造模前肾组织(HE×10)；B:造模前肾组织(HE×40)；C：造模后肾组织(HE×10)；D：造模后肾组织(HE×40)。

图2实验动物造模前后病理变化

3讨论

急性肾衰竭是由各种原因引起的肾功能在短时间内突然下降而出现的氮质废物滞留和尿量减少综合征，其主要表现为氮质废物血肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)升高，水、电解质和酸碱平衡紊乱及全身各系统并发症[4]。目前，临床上主要利用血液透析来维持患者的生命，透析机品种多种多样，各有其优缺点[5-6]。本研究首次使用自主研发的新型组合型肝肾支持系统来进行肾衰竭动物模型的治疗，该支持系统具有独特的特点：(1)能够同时进行肝肾功能支持(人工肝以及CRRT持续性肾脏替代治疗)；(2)能够选择多种治疗模式进行血液净化治疗；(3)高度智能化以及程序机能化，操作简单、方便，能提供数据的安全操作。

本课题组前期实验[3]已经证明该新型组合型肝肾支持系统是安全的。实验中抽取动静脉端血液进行内毒素及需氧、厌氧菌培养，结果显示内毒素水平低于0.5 EU/mL，需氧厌氧菌培养显示未见细菌生长；治疗组动物生命体征平稳，未出现明显波动，两组实验动物在0 h时生命体征差异无统计学意义(P>0.05)，治疗组其余时段与对照组相比，心率和呼吸频率明显低于对照组(P<0.05)，而血氧饱和度和平均动脉压明显高于对照组(P<0.05)，实验动物的生命安全得以保证，再次证实了该机器的安全性。

临床工作中常遇见多器官衰竭的患者，医学工作者不断致力于提高多器官衰竭患者抢救成功率的研究，收到了一定的成效，但是多器官衰竭患者的死亡率依然很高[7]。血液透析患者经输血或接触血液污染的医疗器械发生乙型肝炎的机会明显增加，慢性肾衰维持血液透析患者多伴有免疫功能低下，感染乙型肝炎后病原体不易在体内消失，常成为长期抗原携带者，加上起病隐匿症状轻，易被漏诊和转化为慢性迁延性肝炎，从而导致肝衰竭[8]。在肾衰并发肝衰竭的情况下，应用具有多功能的治疗机器将具有重要的意义；本研究中使用的新型组合型肝肾支持系统能满足这种患者的需求，因此将其应用于临床将具有重大意义。

本实验成功与否的关键在于西藏小型猪肾衰模型的构建，目前构建肾衰竭动物模型的方法主要包括缺血再灌注损伤模型[9-10]、结扎双侧肾动脉模型[11]及药物诱导模型[12]。肾组织缺血是导致肾损伤的常见病理机制，本实验运用结扎双侧肾动脉来构建西藏小型猪急性肾衰竭模型，该方法具有造模时间快，可重复性好等优点。因西藏小型猪各项生化指标与人类较相近[13-14]，所以用其造模并进行治疗，对于临床治疗可提供相应的经验。造模前实验动物的各项生化指标均处于正常水平，造模24 h后均明显升高，治疗组经新型组合型肝肾支持系统治疗后，各项生化指标明显下降，与治疗前相比，差异有统计学意义(P<0.05)；而对照组未出现明显变化。实验中，结扎双侧肾动脉24 h后，发现丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)有所升高，说明肾衰后，对肝功能有一定的影响；经过机器治疗后，AST、ALT明显下降并趋于正常水平。

综上所述，新型组合型肝肾支持系统在治疗过程中，机器运行平稳正常，实验动物生命体征平稳，未出现异常状况，其用于治疗西藏小型猪肾衰模型是安全、有效的，可尝试进一步用于非人灵长类动物试验，并过渡到临床试验。

参考文献

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Experimental study of Tibet miniature pig model of acute renal failure treated by a novel hybrid liver and renal support system*

Feng Lei1,He Guolin1,Xiong Longhui1,Fu Chaoyi1,Huo Xiaolin2,Gao Yi1△

(1.Second Department of Hepatobiliary Surgery,Zhujiang Hospital,Southern Medical University/ Guangdong Provincial Research Center of Artificialorgan and Tissue Engineering/Co-Innovation Center of Organ Failure Research Guangzhou,Guangdong 510282,China;2.Institute of Electrical Engineering Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190,China)

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the novel hybrid liver and renal support system the safety and efficacy of the treatment of Tibet mini pig model of renal failure.MethodsFive Tibet miniature pig bilateral renal artery ligation approached to construct the models of renal failure,treatment group was treated with therapy (CRRT mode) of the novel hybrid liver and renal support system after modeling,while the control group received no treatment.Drawning venous blood endotoxin,biochemical tests and aerobic anaerobic culture when in the treatment of 0,4,8 h;then we observed the changes of biochemical indicators in Tibet mini pigs before and after treatment;we recorded machine pressure monitoring indicators every 2 hour during treatment.ResultsThe model of renal failure of two experimental animals were successfully constructed.The general condition of treatment group was improved after treated by the novel hybrid liver and renal support system,while the control groups continued to deteriorate.The experimental animals did not appear abnormal ECG during the experiment.Two groups of animals showed no statistics significant difference (P>0.05) in the period of 0 h.In the remaining period,heart rate and respiratory rate in treatment group was significantly reduced(P<0.05),while oxygen saturation and mean arterial pressure were significantly increased compared to control group(P<0.05).There was no differences of biochemical indicators between two groups before modeling (P>0.05);after modeling both groups biochemical indicators was significantly increased compared with baseline (P<0.05);after treatment of the hybrid liver and renal support systems in the treatment group,the biochemical parameters were significantly decreased compared with baseline,the difference was statistically significant different(P<0.05),while the control group did not change significantly.Blood endotoxin measured results were less than 0.5 EU/mL,arteriovenous end aerobic anaerobic culture showed no bacterial growth.Pathological examination showed significant swelling of the renal tubular epithelium and tubular necrosis.ConclusionThe novel hybrid liver and renal support system for the treatment of Tibet mini-pig model of renal failure is safe and effective,and it can be further attempts for clinical trials.

[Key words]kidney failure；hybrid liver and renal support system;Tibet miniature pig

doi:·论著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.001

* 基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2012AA020505)；国家自然科学基金资助项目(81470875)；广东省自然科学基金项目(2014A030312013)；广东省级科技计划项目(2014B020227002)；南方医科大学交叉学科创新团队培养计划项目；广东省医学科研基金资助项目(C1036114)。

作者简介：冯磊(1989-)，硕士，住院医师，主要从事生物人工肝的研发与动物实验。△通讯作者：E-mail：gaoyi6146@163.com。

[中图分类号]R692.5

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)08-1009-03

(收稿日期：2015-10-14修回日期：2015-12-15)