辛伐他汀对高糖培养肾小球系膜细胞增殖和细胞周期的影响及机制*

林志鑫,傅君舟△,梁　鸣,崔如健,周道祥,张亚杰

(1.广州市第一人民医院肾内科　510000;2.广州医科大学附属第一医院内科　510120;3.广州市越秀区中医医院检验科　510030;4.广州医学院第二附属医院肾内科　510260)



论著·基础研究

辛伐他汀对高糖培养肾小球系膜细胞增殖和细胞周期的影响及机制*

林志鑫1,傅君舟1△,梁鸣1,崔如健2,周道祥3,张亚杰4

(1.广州市第一人民医院肾内科510000;2.广州医科大学附属第一医院内科510120;3.广州市越秀区中医医院检验科510030;4.广州医学院第二附属医院肾内科510260)

[摘要]目的研究辛伐他汀(SIM)对高糖培养肾小球系膜细胞(GMC)增殖和细胞周期的影响，并观察其炎症因子和细胞外基质的变化。方法将大鼠GMCs分为4组：低糖组[LG组，葡萄糖(Glu)5.6 mmol/L]，高糖组(HG组， Glu 30 mmol/L)， HG+SIM(10 μg/L)组和HG+SIM(25 μg/L)组。采用4-甲基偶氮四唑蓝(MTT)法检测各组细胞的增殖能力，同时比较各组细胞的G0/G1，G2+M期和S期细胞比例。比较各组细胞上清液中的转化生长因子β1(TGF-β1)、纤维黏连蛋白(FN)和Ⅳ型胶原(COL4)水平。结果HG组不同时刻的吸光度(A)高于HG+SIM(10 μg/L)组、HG+SIM(25 μg/L)和LG组，差异有统计学意义(P<0.05)。LG组的G0/G1期细胞比例为(35.67±3.38)%，S期细胞比例为(41.24±5.64)%；HG组的G0/G1期细胞比例为(25.88±4.02)%，S期细胞比例为(28.65±1.88)%；HG+SIM(10 μg/L)组的G0/G1期细胞比例为(28.12±2.01)%，S期细胞比例为(35.55±2.09)%；HG+SIM(25 μg/L)组的G0/G1期细胞比例为(31.85±3.52)%，S期细胞比例为(39.82±2.23)%，差异有统计学意义(P<0.05)。HG组上清液TGF-β1、FN和COL4水平高于HG+SIM(10 μg/L)组、HG+SIM(25 μg/L)和LG组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论SIM可以通过降低TGF-β1水平来抑制GMCs的增殖并调整细胞周期，抑制GMCs肥大。

[关键词]辛伐他汀；肾小球系膜细胞；细胞增殖；细胞周期；转化生长因子β

糖尿病肾病是糖尿病发展的长期并发症，患者晚期基底膜增厚、系膜基质增加，肾小球滤过率下降，部分肾小球功能荒废，患者肾功能下降，出现氮质血症，水肿及高血压等症状[1]。高血糖可以刺激肾小球系膜细胞增生和肥大，最终引起肾小球滤过率下降及肾功能减退[2]。目前，他汀类药物在糖尿病肾病治疗中的应用得到了临床的重视[3]。本次研究旨在研究辛伐他汀(SIM)对高糖培养肾小球系膜细胞(GMC)增殖和细胞周期的影响并对其机制进行探讨。

1材料与方法

1.1材料(1)GMC：HBZY-1细胞由上海蔚通实业有限公司提供。(2)药物：SIM由杭州默沙东制药有限公司提供，批号20150201。(3)试剂：RPMI-1640培养基(R1383)、0.5%胰蛋白酶和D-Hank′s 溶液由美国Gibco公司提供，小牛血清(FCS)由上海浦东高桥畜牧厂提供，4-甲基偶氮四唑蓝(MTT)和二甲亚砜(DMSO)均由美国Sigma公司提供，转化生长因子β1(TGF-β1)ELISA试剂盒和纤维黏连蛋白(FN)ELISA试剂盒由上海岚派生物科技有限公司提供，Ⅳ型胶原(COL4)化学发光免疫试剂盒由北京盛世中方生物科技有限公司提供。

1.2方法

1.2.1液体配制标准RPMI-1640培养液配制：取RPMI-1640粉剂一袋溶于300 mL三蒸水中，称取2 g碳酸氢钠粉末、2 g(11.1 mmol)葡萄糖(Glu)和2.38 g谷氨酰胺粉末溶于上述液体，加三蒸水调剂体积至1 000 mL，并用0.1 mol/L的碳酸氢钠和0.1 mol/L的盐酸溶液调节pH至6.9，用滤菌纸滤过后4 ℃保存备用。低糖RPMI-1640培养液配制：配制高糖培养基时，取RPMI-1640粉剂一袋溶于300 mL三蒸水中，称取2 g碳酸氢钠粉末、1 g(5.6 mmol)Glu、2.38 g谷氨酰胺粉末溶于上述液体，其余方法同标准RPMI-1640培养基的配制。配制高糖培养基时，取RPMI-1640粉剂一袋溶于300 mL三蒸水中，称取2 g碳酸氢钠粉末，5.4 g(30.0 mmol)Glu，2.38 g谷氨酰胺粉末溶于上述液体，其余方法同标准RPMI-1640培养基的配制。

1.2.2细胞培养及传代将-80 ℃保存的HBZY-1细胞于37 ℃水浴快速溶化，用5.0 mL培养基混匀于已融化的细胞悬液，离心机1 500 r/min离心3 min。弃上清，再吸取5.0 mL培养基混匀细胞沉淀，再1 500 r/min离心3 min，弃上清液，细胞沉淀用5.0 mL培养基混匀加入75 cm2方瓶，另加入14.0 mL培养基。于37 ℃、5% CO2孵育箱中培养。当细胞长至70%～80%开始进行传代：弃GMCs原培养液，加入0.25%的胰蛋白酶3～4 mL消化2 min，弃胰蛋白酶溶液。加入10 mL的标准RPMI-1640培养液反复吹打至细胞脱落，将制备的细胞悬液接种于培养基或培养板中继续传代培养。

1.2.3MTT法检测细胞增殖取对数生长期的细胞，制备细胞密度为2×105个/mL的单细胞悬液，将100 μL的细胞悬液加入96孔板中。设置4组，包括：低糖组(LG组，Glu 5.6 mmol/L)18孔，3个时间点，每个时间点6个复孔，高糖组(HG组， Glu 30 mmol/L)18孔， HG+SIM(10 μg/L)组18孔，HG+SIM(25 μg/L)组18孔，4组实验并列同时进行。分别检测各组细胞生长24、48、72 h的细胞浓度：每孔加入100 μL的5 mg/mL的MTT溶液；将24孔板于37 ℃下孵育4 h，弃去液体，每孔加入500 μL DMSO，振荡10 min后采用AMR-100酶标仪在450 nm处测吸光度(A)值，根据A值绘制细胞的生长曲线。

1.2.4细胞周期检测取对数生长期的细胞，制备细胞密度为2×105个/mL的单细胞悬液，将500 μL的细胞悬液置于12孔板中，细胞的分组及处理方式同1.4。将各组细胞于37 ℃、5%CO2孵育箱中培养72 h后进行细胞周期检测：抽取上清液，做好标记后置于-20 ℃中保存。加入0.25%的胰蛋白酶0.2 mL消化2 min，弃胰蛋白酶溶液，加入0.5 mL的RPMI-1640培养液反复吹打至细胞脱落。将单细胞悬液加入2 mL圆底离心管中，1 500 r/min离心,5 min，弃上清液。加入PBS 1 mL离心洗涤1次，弃上清液。加入2 mL预冷的70%乙醇，4 ℃固定30 min，或-20 ℃固定过夜。离心，弃上清液。用1×PBS 1 mL洗涤1次，离心。加入含50 mg/L的含RNA酶的500 μL 1×PBS中，37 ℃孵育30 min，离心。用1×PBS 1 mL洗涤1次，离心。用50 g/L碘化丙啶(PI)溶液进行避光染色30 min后用流式细胞仪分析G0/G1、G2+M期和S期细胞所占的比例。

1.2.5细胞上清液TGF-β1、FN及COL4检测将1.5中制备的细胞上清液于37 ℃下快速解冻，使用ELISA检测上清液中的TGF-β1和FN水平， COL4检测采用化学发光免疫法。

2结果

2.1各组细胞不同时刻的A值比较HG组上不同时刻的A值高于HG+SIM(10 μg/L)组、HG+SIM(25 μg/L)和LG组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1　　各组细胞不同时刻的A值

2.2各组细胞的细胞周期比较各组细胞的G0/G1、G2+M期和S期细胞所占的比例差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。各组细胞72 h时的细胞形态见图2。LG组细胞呈椭圆形，细胞质多有突出，与周围细胞发生接触；HG组细胞呈近圆形，体积增大，突出减少；HG+SIM(10 μg/L)组细胞呈椭圆形，突出减少，部分细胞内出现空泡；HG+SIM(25 μg/L)组细胞呈椭圆形，形态与LG组相比无明显改变。

A:LG组；B：HG组；C：HG+SIM(10 μg/L)组；D:HG+SIM(25 μg/L)组。

图2　　各组细胞72 h的细胞形态(×400)

2.3各组细胞的上清液TGF-β、FN和COL4水平比较各组细胞的上清液TGF-β1、FN和COL4水平差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3　　各组细胞的上清液TGF-β1、FN和COL4

3讨论

研究发现，高血糖是糖尿病肾病发病的重要原因之一：高血糖可以刺激GML增生和肥大，细胞外基质增多，肾小球血管硬化和肾间质纤维化，最终引起肾小球滤过率下降及肾功能减退[4-5]。研究发现，他汀类药物在糖尿病肾病的治疗中具有一定的价值，SIM可以延缓糖尿病肾病的进展[5]。但他汀类药物改善糖尿病肾病患者肾功能的机制目前尚未明确。

本次研究中，HG刺激的3组大鼠GMC的增殖活性明显高于LG培养的GMC，3组细胞不同时刻的A值明显高于LG组。SIM处理的细胞增殖能力明显低于HG组，说明SIM可以抑制GMC的增殖。比较各组细胞的细胞周期，72 h后，HG刺激的3组细胞的G0/G1明显低于LG组细胞。研究发现，高浓度的Glu可以阻碍GML的细胞周期从G1期至S期的转化，GMC的DNA的合成受阻,而RNA与蛋白质的合成增加，导致细胞发生肥大。本次研究中，由于HG的刺激，GMC在G0期活化后便停滞于G1期，细胞不能顺利进入S期，故G0/G1和S期细胞比例减少[6-7]。SIM干预的细胞G0/G1和S期细胞比例高于HG组。故SIM可以改善GMC的肥大，且与剂量相关。

糖尿病患者多伴有脂类代谢的紊乱，他汀类药物可以通过有效的降低血脂而保护肾脏[8]。同时，SIM可以影响多种细胞因子及生长因子，调节炎症性细胞因子的信号传导和细胞增殖及凋亡[9]。本次研究中，HG刺激细胞的上清液TGF-β1水平明显高于LG组，而SIM可以降低TGF-β1和细胞外基质蛋白的水平，且与剂量相关。TGF-β1在糖尿病肾病发生发展中起着重要作用[10]。而HG可能通过形成糖基化终末产物、增加活性氧浓度及增高血管紧张素Ⅱ、活化己糖胺通路等上调TGF-β1的表达，该细胞因子可以通过细胞信号转化途径促进肾小球系膜细胞合成p27，阻止细胞从G1期进入S期，导致细胞肥大[6，11]。同时，TGF-β1可以促进GMC合成细胞基质蛋白，促进GMC的增生。

目前，关于SIM降低TGF-β1水平的机制尚未研究明确。SIM可能是通过影响细胞因子、生长因子及激素的跨膜信号传导而抑制TGF-β1基因的表达。他汀类药物可以减少法尼酯焦磷酸的合成，从而抑制生长因子与其受体的结合，减少p21ras途径的激活，有效抑制p21ras介导的有丝分裂信号传导[12]。同时，他汀类药物可以抑制c-fos和c-jun的表达，减轻细胞的炎性反应[13]。综上所述，SIM可以通过降低TGF-β1水平来抑制GMC的增殖并调整细胞周期，抑制GMCs肥大。

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Effect and mechanism of simvastatin on proliferation and cycle of glomerular mesangial cells cultured in high-concentration glucose*

LinZhixin1,FuJunzhou1△,LiangMing1,CuiRujian2,ZhouDaoxiang3，ZhangYajie4

(1.DepartmentofNephrology,GuangzhouFirstPeople′sHospital,Guangzhou,Guangdong510000,China;2.DepartmentofNephrology,theFirstAffiliatedhospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510120,China;3.DepartmentofClinicalLaboratory,YuexiuDistrictTraditionalChineseMedicineHospital,Giamgzhou,Guangdong510030,China;4.DepartmentofNephrology,theSecondAffiliatedhospitalofGuangzhouMedicalCollege,Guangdong,Guangzhou510260,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of simvastatin(SIM) on the proliferation and cycle of glomerular mesangial cells(GMCs) cultured in high concentration of glucose,and to observe the variation of inflammation factor and extracellular matrix.MethodsGMCs of rats were divided into 4 groups:low glucose(LG) group(Glu 5.6 mmol/L),High glucose (HG) group(Glu 30 mmol/L)， HG+SIM(10 μg/L)group and HG+SIM group(25 μg/L).Cells′ proliferation activity was tested by MTT,simultaneously compared the ratio of cells in different period (G0/G1,G2+M and M),and levels of TGF-β1,FN and COL4 were compared among different groups.ResultsAbsorbancy (A) of different periods in HG group was higher than that in other 3 groups,difference had statistical significance(P<0.05).In LG group,the ratio of cells in G0/G1 were(35.67±3.38)% while S-stage were(41.24±5.64)%;in HG group,the ratio of cells in G0/G1 were(25.88±4.02)% while S-stage were(28.65±1.88)%；in HG+SIM(10 μg/L)group,the ratio of cells in G0/G1 were(28.12±2.01)% while S-stage cell were(35.55±2.09)%;in HG+SIM(25 μg/L) group,the ratio of cells in G0/G1 were(31.85±3.52)%，while in S-stage were(39.82±2.23)%， the difference had statistical significance(P<0.05).Levels of TGF-β1,FN and COL4 in HG group were higher than those of in HG+SIM(10 μg/L)group,HG+SIM(25 μg/L)group and LG group,the difference had statistical significance(P<0.05).ConclusionBy decreasing TGF-β1 level,simvastatin can inhibit the proliferation of GMCs and regulate the cell cycle,to suppress the hypertrophy of GMCs.

[Key words]simvastatin;glomerular mesangial cells;cell proliferation;cell cycle;transforming growth factor β

doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.01.009

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81000291)。

作者简介：林志鑫(1976-)，副主任医师，硕士，主要从事主要从事肾脏疾病，血液透析、腹膜透析方面的研究。△通讯作者，E-mail:fujzhou@163.com。

[中图分类号]R587.2

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)01-0024-03

(收稿日期：2015-09-15修回日期：2015-10-20)