ISCOM型白血病瘤苗联合1-甲基色氨酸免疫治疗荷瘤小鼠疗效观察*

黄　琰，吴　隼，字友梅，张　媛，杨　满，马　栋，贺立山

(新乡医学院第一附属医院血液科，河南新乡 453100)



论著·基础研究

ISCOM型白血病瘤苗联合1-甲基色氨酸免疫治疗荷瘤小鼠疗效观察*

黄琰，吴隼，字友梅，张媛，杨满，马栋，贺立山

(新乡医学院第一附属医院血液科，河南新乡 453100)

[摘要]目的探讨免疫刺激复合物(ISCOM)型白血病肿瘤疫苗(简称瘤苗)联合1-甲基色氨酸对荷瘤小鼠的治疗作用。方法皂苷溶液中加入脂肪酶蛋白(1 mg/mL)7 ℃反应12 h，加入80 μL脂类混合物溶液和5 mL皂苷溶液(1 mg/mL)制备ISCOM型白血病瘤苗。C57BL/6小鼠分为模型组、ISCOM型白血病瘤苗组、1-甲基色氨酸组和联用组(ISCOM型白血病瘤苗+1-甲基色氨酸)，小鼠注射FBL-3细胞建立白血病荷瘤小鼠模型，模型组给予等量生理盐水，其余各组接受对应药物治疗4周后，记录体质量，NK细胞、Mφ细胞和细胞毒T淋巴细胞(CTL)细胞杀伤活性、血清IL-10和IL-12表达水平。结果联用组瘤质量低于1-甲基色氨酸组和ISCOM型白血病瘤苗组[(0.64±0.26)g vs.(2.49±0.91)g，P<0.01；(0.64±0.26)g vs.(1.28±0.73)g，P<0.05)]；联用组Mφ细胞杀伤活性显著高于1-甲基色氨酸组[(55.69±13.69)% vs.(69.47±14.79)%，P<0.01)]；联用组NK细胞杀伤活性显著高于1-甲基色氨酸组[(38.41±8.27)% vs.(67.22±12.74)%，P<0.01]；联用组CTL细胞杀伤活性高于1-甲基色氨酸组和ISCOM型白血病瘤苗组[(43.77±8.89)% vs.(69.68±11.44)%，P<0.01；(58.87±9.45)% vs.(69.68±11.44)%，P<0.05)]；联用组IL-10均显著低于1-甲基色氨酸组、ISCOM型白血病瘤苗组[(76.2±6.82)pg/L vs.(98.3±13.4)pg/L，P<0.01；(76.2±6.82)pg/L vs.(202.3±44.5)pg/L，P<0.01)]；联用组IL-12高于1-甲基色氨酸组、ISCOM型白血病瘤苗组[(381.2±47.3)pg/L vs.(332.1±30.2)pg/L，P<0.05；(381.2±47.3)pg/L vs.(291.2±17.3)pg/L，P<0.01)。结论ISCOM白血病瘤苗联合1-甲基色氨酸具有较佳的抗瘤活性，其机制可能是通过介导IL-10和IL-12的表达。

[关键词]ISCOM型瘤苗；1-甲基色氨酸；前体细胞淋巴母细胞白血病/淋巴瘤；联用

免疫治疗是肿瘤治疗研究的方向，免疫疗法治疗血液系统恶性肿瘤倍受人们的关注，国内外在主动免疫治疗白血病方面研究甚热。肿瘤疫苗(简称瘤苗)在现代肿瘤治疗中作为肿瘤术后、化学治疗、放射治疗的一种辅助治疗手段越来越受到关注[1-2]。1-甲基色氨酸能够抑制免疫调节细胞及肿瘤细胞中的2，3双加氧酶活性，促进细胞毒T淋巴细胞(CTL)的活化、增殖，发挥抗肿瘤作用[3]。免疫刺激复合物(immunostimulating complexes，ISCOM)是一种全新的抗原提呈系统，是荷载肽或蛋白质抗原的脂类载体复合物，具有佐剂和抗原提呈的双重功能。本研究在前期研究中发现ISCOM型白血病瘤苗可以改善荷瘤小鼠的免疫功能，发挥抗癌作用。本文拟通过联合使用1-甲基色氨酸探讨其与ISCOM型白血病瘤苗是否有协同抗癌作用。

1材料与方法

1.1动物与细胞C57BL/6小鼠40只，6～8周龄，体质量18.0～22.0 g，雌雄各半，购自新乡医学院实验动物中心。FBL-3细胞株购自中山大学实验动物中心。

1.2试剂小鼠IL-10 ELISA试剂盒(华美生物工程公司)；小鼠IL-12 ELISA试剂盒(华美生物工程公司)；RPMI1640培养基(GIBCO,美国)；脂肪酶蛋白(SIGMA,美国)；卵磷脂(SIGMA,美国)；胆固醇(SIGMA,美国)；丝裂霉素C(SIGMA,美国)；胎牛血清(GIBCO,美国)；MTT(SIGMA,美国)；皂苷(SIGMA,美国)；Mega-10(Amresco,美国)。ISCOM型白血病瘤菌的制备[4]：皂苷溶液中加入脂肪酶蛋白(1 mg/mL)使其浓度为0.02 mg/mL，7 ℃反应12 h，随后加入80 μL脂类混合物溶液和5 mL皂苷溶液(1 mg/mL)，室温下反应4 h。冰浴超声处理，透析，浓缩，4 ℃保存备用。脂类混合物溶液的配制：将卵磷脂和胆固醇溶解于20%的Mega-10溶液中，调整浓度为10 mg/mL；皂苷溶液的配制：皂苷溶解于PBS溶液中，调整浓度为1 mg/mL。FBL-3细胞内加入丝裂霉素C(100 μg/mL)，于37 ℃水浴中放置30 min，灭活[5]。

1.3方法[6]所有小鼠均建立荷瘤小鼠模型，FBL-3培养于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，取0.2 mL 1×106/mL细胞注射于鼠左肋皮下于3～7 d可触及肿瘤后。取造模成功的小鼠40只分为模型组、ISCOM型白血病瘤苗组、1-甲基色氨酸组和联用组，每组10只。 给药：模型组给予等量生理盐水，ISCOM型白血病瘤苗组治疗时在肿瘤部位注射瘤苗0.2 mL，1周1次；1-甲基色氨酸组于饮用水中加入5 mg/mL 1-甲基色氨酸，自由饮水；联用组在肿瘤部位注射瘤苗0.2 mL，同时饮用1-甲基色氨酸。治疗维持4周。

1.4疗效观察及检测指标治疗4周后，处死小鼠，分离瘤体，称取质量。参考文献方法分离获得NK细胞、Mφ细胞和CTL细胞，采用MTT考察测量各组治疗后细胞杀伤活性。Mφ(NK/CTL)的杀伤活性=[1-与Mφ(NK/CTL)作用的L1210OD值/对照L1210OD值]×100%。分离小鼠腹主动脉血，静置离心分离获得血清，采用ELISA试剂盒测定IL-10和IL-12水平。

1.5统计学处理采用SPSS13.0软件进行统计分析，计数资料比较采用χ2检验，计量资料比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组小鼠瘤质量和抑瘤率比较治疗结束后，模型组瘤质量(4.08±2.09)g；1-甲基色氨酸组瘤质量(2.49±0.91)g，抑瘤率为38.9%；ISCOM型白血病瘤苗组瘤质量(1.28±0.73)g，抑瘤率为68.6%；联用组瘤质量(0.64±0.26)g，抑瘤率为84.3%。1-甲基色氨酸组瘤质量低于模型组(P<0.05)，ISCOM型白血病瘤苗组和联用组显著低于模型组(均P<0.01)；联用组瘤质量低于1-甲基色氨酸组和ISCOM型白血病瘤苗组(P<0.01，P<0.05)。见图1、表1。

A：模型组；B：1-甲基色氨酸组；C：ISCOM型白血病瘤苗组；D：联用组。

图1　　各组肿瘤大小

a:P<0.05，b：P<0.01,与模型组比较;c:P<0.05，d：P<0.01,与联用组比较。-:此项无数据。

2.2各组Mφ、CTL和NK细胞杀伤活性比较1-甲基色氨酸组、ISCOM型白血病瘤苗组和联用组Mφ细胞杀伤活性均显著高于模型组(均P<0.01)，联用组Mφ细胞杀伤活性显著高于1-甲基色氨酸组(P<0.01)；ISCOM型白血病瘤苗组和联用组NK细胞杀伤活性显著高于模型组(均P<0.01)，联用组NK细胞杀伤活性显著高于1-甲基色氨酸组(P<0.01)；1-甲基色氨酸组、ISCOM型白血病瘤苗组和联用组CTL细胞杀伤活性均显著高于模型组(均P<0.01)，联用组CTL细胞杀伤活性高于1-甲基色氨酸组和ISCOM型白血病瘤苗组(P<0.01，P<0.05)。见表2。

表2　　各组Mφ、CTL和NK细胞杀伤活性比较

b:P<0.01,与模型组比较;c:P<0.05，d:P<0.01,与联用组比较。

2.3各组IL-10和IL-12比较1-甲基色氨酸组、ISCOM型白血病瘤苗组和联用组IL-10均显著低于模型组(均P<0.01)，联用组IL-10均显著低于1-甲基色氨酸组、ISCOM型白血病瘤苗组(均P<0.01)；1-甲基色氨酸组、ISCOM型白血病瘤苗组和联用组IL-12均高于模型组(P<0.05，P<0.01)，联用组IL-12高于1-甲基色氨酸组、ISCOM型白血病瘤苗组(P<0.05，P<0.01)。见表3。

表3　　各组IL-10和IL-12比较

a:P<0.05，b:P<0.01，与模型组比较;c:P<0.05，d:P<0.01,与联用组比较。

3讨论

白血病目前的治疗仍然以化学治疗为主，但化学治疗产生的不良反应及耐药性限制了其的使用，造血干细胞移植可以治愈白血病，但受制于供体少、手术死亡率高和费用高等因素[7]。白血病的主动免疫治疗日益受到重视，主动免疫的机理是特异性肿瘤抗原通过抗原呈递细胞激活T淋巴细胞成为CTL，CTL识别肿瘤细胞后释放多种杀伤因子[8]。

本研究前期研究中发现ISCOM型白血病瘤苗能够分别通过增强荷瘤小鼠的Mφ细胞活性和CTL细胞活性达到改善荷瘤小鼠非特异性免疫和细胞免疫功能的作用，且该瘤苗制备简单、使用方便。1-甲基色氨酸是吲哚2，3双加氧酶的竞争性抑制剂，通过封闭黑色素瘤细胞系中吲哚2，3双加氧酶的表达，能显著增强T细胞的免疫功能[9-10]。采用吲哚2，3双加氧酶的竞争性抑制剂1-甲基色氨酸和传统化学治疗、放射治疗结合可以取得更佳的治疗效果，而通过1-甲基色氨酸可以增强LLC/DC融合疫苗的抗肿瘤效果，诱导强CTL反应[11]。为此本研究中考察了ISCOM型白血病瘤苗联合1-甲基色氨酸在荷瘤小鼠中的治疗效果。研究结果显示，联用组抑瘤率为84.3%，瘤质量显著低于甲基色氨酸组和ISCOM型白血病瘤苗组(P<0.05)。Mφ细胞、CTL细胞和NK细胞杀伤活性中，联用组显著优于1-甲基色氨酸组，但与ISCOM型白血病瘤苗组效果相当，仅CTL优于ISCOM型白血病瘤苗组，该结果与其他研究类似，可能与1-甲基色氨酸对于CTL具有较强作用有关[12]。

IL-10是一种由Th2细胞、单核/巨噬细胞、B 淋巴细胞和角化细胞产生的细胞因子，IL-10 具有免疫抑制作用，可以抑制抗原提呈细胞、CTL 细胞及 NK 细胞的活力[13-14]。而IL-12是一种抗原提呈细胞和 B 细胞产生的细胞因子，是最有效的CTL 和 NK 细胞活性激活因子[15]。本研究显示联用组能显著抑制IL-10的表达，促进IL-12的产生，这可能是联用1-甲基色氨酸和ISCOM型白血病瘤苗发挥抗瘤的作用机制。

综上所述，联用1-甲基色氨酸和ISCOM型白血病瘤苗具有更佳的抗瘤活性，主要增加了CTL细胞杀伤活性，而对IL-10和IL-12表达的调节可能为其作用机理。

参考文献

[1]陈香丽,王连才,张王刚,等.白血病肿瘤疫苗联合1-甲基色氨酸免疫治疗荷瘤小鼠疗效观察[J].白血病·淋巴瘤,2011,20(7):395-397,400.

[2]Mattarollo SR,West AC,Steegh K,et al.NKT cell adjuvant-based tumor vaccine for treatment of myc oncogene-driven mouse B-cell lymphoma[J].Blood,2012,120(15):3019-3029.

[3]刘燕,张瑞,武希润，等.1-甲基色氨酸对荷肝癌小鼠皮下移植瘤生长的抑制作用[J].中华肝胆外科杂志,2011,17(11):924-927.

[4]Ahlberg V，Lövgren Bengtsson K,Wallgren P,et al.Global transcriptional response to ISCOM-Matrix adjuvant at the site of administration and in the draining lymph node early after intramuscular injection in pigs[J].Dev Comp Immunol,2012,38(1):17-26.

[5]Lovgren BK,Morein B,Osterhaus AD,et al.ISCOM technology-based matrix M adjuvant:success in future vaccines relies on formulation[J].Expert Rev Vaccines,2011,10(4):401-403.

[6]Sakamaki I,Kwak LW,Cha SC,et al.Lenalidomide enhances the protective effect of a therapeutic vaccine and reverses immune suppression in mice bearing established lymphomas[J].Leukemia,2014,28(2):329-337.

[7]赵月莹.CTL克隆细胞在白血病中的初步研究[D].北京：中国人民解放军军事医学科学院,2012.

[8]吴隼,黄琰,马栋，等.免疫刺激复合物型白血病瘤苗对荷瘤小鼠免疫功能的影响[J].广东医学,2014,35(15):2321-2322.

[9]王改,申惠琴,武希润，等.1-甲基色氨酸与5-氟尿嘧啶联合干预对荷胃癌小鼠髓源性抑制细胞的影响[J].中华普通外科杂志,2014,29(6):464-466.

[10]Minami Y,Fukushima N,Sadarangani A,et al.Treatment with Hedgehog inhibitor PF-913 attenuates leukemia-initiation potential in acute myeloid leukemia cells[J].Cancer Res,2014,74(19 Supple):1884.

[11]刘燕.1-甲基色氨酸对荷肝癌小鼠皮下移植瘤生长抑制作用的研究[D].太原：山西医科大学,2011.

[12]Gu X,Erb U,Büchler MW,et al.Improved vaccine efficacy of tumor exosome compared to tumor lysate loaded dendritic cells in mice[J].Int J Cancer,2015,136(4):E74-E84.

[13]Moore DP,Hodgins DC,Firth MA,et al.Incorporation of antigens from mannheimia haemolytica culture supernatant,and recombinant bovine C3d into ISCOM matrix using neutravidin-biotin interaction[J].Biotechnol Appl Biochem,2011,58(pt.3):198-202.

[14]Zhou Q,Munger ME,Veenstra RG,et al.Coexpression of Tim-3 and PD-1 identifies a CD8+T-cell exhaustion phenotype in mice with disseminated acute myelogenous leukemia[J].Blood,2011,117(17):4501-4510.

[15]Rasool MH.Preparation and evaluation of an experimental iscom-based infectious bursal disease vaccine[J].Indian J Microbiol,2008,48(3):401-404.

The treatment effect of ISCOM leukemia vaccine combination with 1-methyl tryptophan on tumor burden mice*

HuangYan,WuSun,ZiYoumei,ZhangYuan,YangMan,MaDong,HeLishan

(DepartmentofHematology,theFirstHospitalAffiliatedtoXinxiangMedicineCollege,Xinxiang,Henan453100,China)

[Abstract]ObjectiveInvestigated the treatment effect of ISCOM leukemia vaccine combination with 1-methyl tryptophan on tumor burden mice.MethodsSaponin was added lipase protein (1 mg/mL) 7 ℃ for 12 h,adding 80 μL lipid mixed solution and 5 mL saponin solution (1 mg/mL) to prepare ISCOM leukemia vaccine.C57BL/6 mice were randomly divided into model group,ISCOM leukemia vaccine group,1-methyl tryptophan group and combination group,Mice were injected FBL-3 cell to built leukemia tumor-burdened mice model.After treatment for 4 weeks,tumors weight,NK and Mφ and CTL cell killing activity,serum levels of IL-10,IL-12 were detected.ResultsTumor weight in combination group was less than 1-methyl tryptophan and ISCOM leukemia group [(0.64±0.26)g vs.(2.49±0.91)g,P<0.01,(0.64±0.26)g vs.(1.28±0.73)g,P<0.05];NK cell killing activity in combination group was higher than 1-methyl tryptophan group[(38.41±8.27)% vs.(67.22±12.74)%,all P<0.01)];Mφ activity in combination group was significantly higher than 1-methyl tryptophan group[(55.69±13.69)% vs.(69.47±14.79)%,P<0.01];CTL activity in combination group was significantly higher than 1-methyl tryptophan group and ISCOM leukemia group[(43.77±8.89)% vs.(69.68±11.44)%,P<0.01,(58.87±9.45)% vs.(69.68±11.44)%,P<0.05];IL-10 in combination group were significantly lower than 1-methyl tryptophan group and ISCOM leukemia group [(76.2±6.82)pg/L vs.(98.3±13.4)pg/L,P<0.01,(76.2±6.82)pg/L vs.(202.3±44.5)pg/L,P<0.01];IL-12 in combination group were significantly higher than 1-methyl tryptophan group and ISCOM leukemia group[(381.2±47.3)pg/L vs.(332.1±30.2)pg/L,P<0.05,(381.2±47.3)pg/L vs.(291.2±17.3)pg/L,P<0.01].ConclusionCombination with 1-methyl tryptophan and ISCOM leukemia vaccine has a well antitumor effect,its mechanism may be through mediated and the expression of IL-12 and IL-10.

[Key words]ISCOM leukemia vaccine;1-methyl tryptophan;precursor cell lymphoblastic leukemia/lymphoma;combination

doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.01.013

基金项目：河南省教育厅基金资助项目(2006320039)。

作者简介：黄琰(1976-)，副主任医师，硕士，主要从事白血病的免疫治疗。

[中图分类号]R733

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)01-0037-03

(收稿日期：2015-06-16修回日期：2015-09-21)