肾移植受者多反应性抗体与HLA抗体的相关性研究

荣春书，王伟刚，连　鑫，高宝山*

(1.长春中医药大学附属医院，吉林 长春130021；2.吉林大学第一医院 泌尿系统疾病诊治中心，吉林 长春130021)



*通讯作者

肾移植受者多反应性抗体与HLA抗体的相关性研究

荣春书1，王伟刚2，连鑫2，高宝山2*

(1.长春中医药大学附属医院，吉林 长春130021；2.吉林大学第一医院 泌尿系统疾病诊治中心，吉林 长春130021)

摘要：目的从单克隆抗体水平研究同种异体肾移植受者多反应性抗体与HLA抗体的相关性，探讨多反应性抗体是否为HLA抗体尤其是非供体特异性抗体产生的原因之一。方法从肾移植患者外周血细胞及手术切除的移植肾组织中分离出B淋巴细胞，并于体外永生化培养获得单克隆B细胞，分别检测B细胞分泌的抗体对HLA抗原及凋亡细胞的反应性。结果共获得107个B细胞克隆，检测发现每个B细胞克隆在体外培养过程中均分泌抗体。其中有4个单克隆B细胞分泌的抗体可以与多种HLA抗原发生反应，而这些HLA抗原之间并非都有共用的抗原决定簇。进一步研究发现，这4种单克隆抗体均可以与凋亡细胞发生反应，从而表现为抗体的多反应性。结论本研究从单克隆细胞、抗体水平揭示了多反应性抗体的存在与HLA抗体的相关性，在交叉反应理论之外，为HLA抗体尤其是非供体特异性抗体的产生原因提供了实验依据。

关键词：肾脏移植；多反应性抗体；HLA抗体；凋亡

(ChinJLabDiagn,2016,20:0703)

目前，同种异体肾移植手术是治疗慢性肾功能衰竭的最有效方法。器官移植致敏后产生的抗体主要为特异性抗供者HLA的抗体，即供体特异性抗体(Donor specific antibodies，DSA)，然而研究发现，肾移植受者血清中亦可检测出非供体特异性抗体(Non-donor specific antibodies，NDSA)的出现[1-4]，在无特异性免疫致敏的前提下，NDSA产生的原因尚不完全明确。

自然抗体(Natural antibodies)是一类未经免疫致敏而广泛存在于人类血清中的抗体[5]。自然抗体由于能够与抗原决定簇毫不相关的多种抗原发生反应，故表现出多反应性的特点。自然抗体的重要特性是能够与凋亡细胞结合[6-8]。长期以来，对多反应性抗体的研究主要集中于人类自身免疫性疾病领域，而针对多反应性抗体在器官移植领域的研究却罕有报道。鉴于多反应性抗体的特性，在本研究中，我们从单克隆B细胞、抗体水平探寻多反应性抗体与HLA抗体产生的相关性。

1资料与方法

1.1一般资料

本研究B淋巴细胞来源于：①一位肾移植术后一年患者的液氮中冻存的外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)；②因抗体介导排异反应而失功并被手术切除的移植肾。

1.2方法

1.2.1B淋巴细胞克隆的分离及免疫纯化 将切除的移植肾在超净台中剪碎、研磨，并通过70 μm滤网过滤制成细胞悬液。聚蔗糖溶液中利用密度梯度法将白细胞从移植肾组织碎片中分离，利用CD19磁珠(BD公司)将CD19+的B淋巴细胞从白细胞中免疫纯化。

1.2.2B淋巴细胞的体外永生化在96孔V底细胞培养板的每孔中加入50 μl由EBV转染的狨猴B95-8细胞株培养上清液(其内含EBV)，再向每孔中加入50 μl含20% FCS的RPMI 1640，含50000个经5Gy射线照射的Jurkat细胞做为支持细胞。最后向每孔中加入CpG 2006，最终浓度为2.5 μg/ml。将稀释后的纯化B细胞悬液注入细胞培养板的各孔中，每孔30个细胞，将培养板置入37℃ 5% CO2细胞孵育箱中持续培养。直至从细胞培养孔中见到增大的细胞集落，将永生化的B细胞分别转入细胞培养瓶中持续培养并扩增，待各淋巴细胞克隆增殖至106/ml，收集培养上清液-20℃保存待用。

1.2.3凋亡细胞制备Jurkat细胞株0.5×106/ml与200 ng/ml抗FAS抗体于37℃孵育箱内15小时。Annexin-V及7-AAD(BD公司)染色以确认细胞凋亡。

1.2.4细胞培养上清液所含抗体对凋亡细胞的反应性1×106经诱导凋亡的Jurkat细胞分别与100 μl B细胞克隆培养上清液在FACS试管中混匀，37℃孵育30 min。洗涤后向细胞混悬液的试管中分别加入抗Pan Ig-FITC，4℃避光反应30 min。洗涤后弃上清并混匀细胞。应用流式细胞仪检测抗体对凋亡细胞的反应性，选取经染色确认的凋亡细胞群，Log2-平均荧光强度(Mean Fluorescence intensity，MFI)用以代表抗体对凋亡细胞的反应性。

1.2.5细胞培养上清液所含抗体对HLA及MICA的反应性将包被有混合MHC Ⅰ类、Ⅱ类抗原及MICA的混合微球悬液(Mixed beads)加入V型底96孔检测板，每孔5 μl，挑选出对凋亡细胞反应阳性的B细胞培养上清液20 μl分别加入各孔，水平摇床避光混匀30 min。洗涤2次后向反应体系加入IgM-PE二抗，水平摇床避光混匀30 min。洗涤两次后弃上清，加入80 μl PBS缓冲液充分混匀后，应用Luminex 200检测仪检测细胞培养上清液对HLA及MICA的反应性，MFI>1000被定义为阳性反应。选取Mixed beads检测阳性的B细胞培养上清液，分别应用HLA Class I regular beads(主要为人工合成HLA抗原)、Class I iBEADS(主要含天然HLA抗原)及酸处理过的Class I beads(使隐蔽抗原暴露)检测患者细胞培养上清液中所包含的HLA抗体。

2结果

2.1永生化B淋巴细胞克隆所分泌抗体对HLA抗原的反应性

本研究中，通过B淋巴细胞体外永生化，我们共获得107个B细胞克隆，通过检测发现每个B细胞克隆在体外培养过程中均分泌抗体。Luminex Mixed Beads检测发现其中有4个细胞克隆(编号分别为2B4、2D9、4G4、4G10)分泌的抗体能够与HLA I类抗原发生反应。为进一步鉴定这些抗体具体可以与哪些HLA I类抗原反应，我们分别将三种不同的HLA I类抗原微球用于下一步实验：HLA Class I regular beads(主要为人工合成HLA抗原)、Class I iBEADS(主要为天然HLA抗原)及酸处理过的Class I beads(使隐蔽抗原暴露)，结果发现：4个不同的B淋巴细胞集落分泌的抗体可同时与多种HLA I类抗原反应。具体检测结果见图1。

2B4：此抗体主要与三种微球的HLA-B、HLA-C抗原反应。反应性最强的为酸处理微球B*27:05及B*27:08抗原，这两种抗原共用抗原决定簇5011。但抗体2B4所识别的其他多种HLA抗原并不共用相同的抗原决定簇。同时，此抗体还与包被于iBEADS上的多种Cw抗原发生反应，这些Cw抗原共用抗原决定簇69R。

2D9：此抗体主要与包被于regular beads上的Regular single antigen beads(人工合成抗原)用红色柱状图(中粗线)表示，iBEADS(天然抗原)用蓝色柱状图(深色粗线)表示，酸处理过的Regular single antigen beads(隐蔽抗原)用绿色柱状图(细线)表示。柱状图高度分别代表抗体对HLA I类抗原分子的反应强度(MFI)。

图1B细胞克隆2B4、2D9、4G4、4G10所分泌的抗体分别对HLA I类抗原分子的反应性

HLA-A及HLA-C抗原发生反应。但这些抗原并无共用的抗原决定簇。同时此抗体还与包被于iBEADS上的抗原A23、A24及A29发生反应，但这几种抗原也无共用的抗原决定簇。此外，抗体2D9也可与包被于酸处理beads上的诸多抗原反应，而这些抗原之间也并无共用的抗原决定簇。

4G4：此抗原与包被于regular beads上的抗原C*06:02反应性最强，同时与多种HLA-B及HLA-C抗原发生反应，而这些抗原无共用的抗原决定簇。此抗原与包被于iBEADS上的抗原A69、B44、Cw2、Cw4、Cw5、Cw7、Cw12等发生反应，这些抗原之间亦无共用的抗原决定簇。同时，抗体4G4能够与多种包被于酸处理微球上的诸多HLA-A、HLA-B及HLA-C抗原反应，而这些抗原也无共用抗原决定簇。

4G10：与2B4、2D9、4G4抗体不同，此抗体可以与包被于regular beads及酸处理beads上的大多数HLA-B及HLA-C抗原发生反应，但与包被于iBEADS上的抗原不发生反应。以上诸多抗原中并无共用抗原决定簇。

2.2永生化B淋巴细胞克隆所分泌抗体对凋亡细胞的反应性

自然抗体是一类未经免疫致敏而广泛存在于人类血清中的抗体，自然抗体由于能够与抗原决定簇毫不相关的多种抗原发生反应，从而表现出多反应性的特点。而自然抗体的重要特性之一是能够与凋亡细胞结合。因此在本研究中，我们分别检测了HLA阳性抗体2B4、2D9、4G4、4G10这4种单克隆抗体能否与凋亡细胞结合，从而揭示其多反应性。结果显示，与阴性抗体3D4克隆对照，这四种多反应性抗体均能够与凋亡细胞发生反应(图2)，说明这四种HLA阳性的单克隆抗体同时也是多反应性抗体。

3讨论

抗体做为一个重要因素广泛参与实体器官移植受者对移植物的急性及慢性排异反应。在ABO血型相容的供受者匹配中，器官移植致敏后产生的抗体主要为特异性抗供者HLA抗体，然而在研究中发现，肾移植患者血清中亦可检测出大量的非供体特异性的HLA抗体(NDSA)[1-4]，在无特异性免疫致敏的前提下，NDSA产生的原因尚不完全明确。目前普遍接受的解释为交叉反应原理[9-12]。即由于多种HLA之间存在共用的抗原决定簇，故肾移植患者血清中产生DSA的同时也可以与供者相似的HLA抗原发生反应，从而表现为NDSA的出现。然而，有研究发现，肾移植患者在没有产生DSA的Anti-Fas诱导Jurkat细胞后，应用Annexin V及7-AAD区分凋亡细胞与非凋亡细胞。非多反应性B细胞克隆3D4分泌的抗体做为阴性对照。

图2多反应性B细胞克隆2B4、2D9、4G4、4G10分泌的抗体与诱导凋亡后的Jurkat细胞的反应性

情况下也可产生NDSA，肾移植术后NDSA出现的平均中位时间甚至早于DSA[9]。显然交叉反应理论不能完全解释这种现象。

我们通过研究发现，多反应性抗体2B4、2D9、4G4、4G10同时也能够与多种HLA抗原发生反应。本研究从单克隆抗体水平，首次应用三种不同特征的HLA I类抗原包被的微球同时检测克隆2B4、2D9、4G4、4G10对HLA抗原的反应性。这三类微球的特点分别为：HLA Class I regular beads主要含人工合成HLA抗原，Class I iBEADS主要为天然HLA抗原，酸处理过的Class I beads将天然构象中的隐蔽HLA抗原暴露出来。我们通过检测发现，无论应用哪种检测方法，这4种抗体均可以与多种HLA抗原反生反应，而绝大多数HLA抗原之间并不共用相同的抗原决定簇，由此充分说明，本研究发现的单克隆多反应性抗体，是基于它们的多反应性从而与多种HLA抗原发生反应，而并非完全由于与相同或相似的抗原决定簇发生反应从而表现为与多种HLA发生的交叉反应。因此，本研究从单克隆细胞、抗体水平揭示了多反应性抗体的存在与HLA抗体的相关性，在交叉反应理论之外，为HLA抗体尤其是非供体特异性抗体的产生原因提供了理论及实验依据。

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The accociation between serum polyreactive antibodies and HLA antibodies in kidney transplant recipients

RONGChun-shu1,WANGWei-gang2,LIANXin2,etal.

(1.TheAffiliatedHospitaltoChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130021,China;2.UrologyCenter,theFirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the association between serum polyreactive antibodies and HLA antibodies in kidney transplant recipients at monoclonal antibody level,to explore whether the generation of HLA antibodies could be attributed to polyreactive antibodies partially.MethodsB cell were isolated form PBMC of transplant recipients and explanted kidney allograft respectively,then monoclonal B cell clones were obtained through in vitro culture.The reactivity of antibodies secreted by B cell clones to HLA antigens and apoptotic cells was assessed.Results107 B cell clones were generated,all B cell clones have the capacity of secreting antibodies.The monoclonal antibodies secreted from four B cell clones could react to multiple HLA molecules but did not appear to target canonical “shared” epitopes.Further investigation showed that these antibodies reacted to apoptotic cells thereby revealed polyreactivity.Conclusion Our studies revealed the correlation between serum polyreactive antibodies and HLA antibodies in kidney transplant recipients at monoclonal cells and antibodies,and provided experimental basis for the explanation of generation of non-donor specific antibodies besides the cross reactivity theory.

Key words:Kidney transplantation;Polyreactive antibodies;HLA antibodies;Apoptosis

基金项目：国家自然科学基金青年基金项目81501381；吉林省自然科学基金项目20160101100JC;吉林省卫生计生青年课题项目2015Q004

文章编号：1007-4287(2016)05-0703-04

中图分类号：R392.4

文献标识码：A

作者简介：荣春书，35岁，女，硕士，主治医师，主要研究方向：神经免疫。

(收稿日期：2016-01-15)