无创性远隔肢体缺血后适应对大鼠急性脑缺血的影响

常莉莎，张云鹤，彭延波，张　江*，王大力

(华北理工大学附属医院 1.神经内二科;2.神经外科，河北 唐山063000)



*通讯作者

无创性远隔肢体缺血后适应对大鼠急性脑缺血的影响

常莉莎1，张云鹤2，彭延波1，张江1*，王大力1

(华北理工大学附属医院 1.神经内二科;2.神经外科，河北 唐山063000)

摘要：目的探讨无创性远隔肢体缺血后适应对大鼠急性脑缺血的保护作用及机制。方法54只雄性SD大鼠随机分为3组，每组18只：假手术组(sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、远隔肢体缺血后适应组(RPC组)，比较3组大鼠神经功能缺损评分、脑含水量、脑梗死体积、海马CA1区细胞形态学变化和凋亡细胞水平。结果与I/R组比较，RPC组脑缺血再灌注损伤减轻，神经缺损评分降低，脑含水量减少，脑梗死体积减小，锥体细胞损伤明显减轻，退变神经元明显减少，凋亡水平降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论无创性远隔肢体缺血后适应在缺血性脑血管病急性期具有神经保护作用，其机制可能是通过降低神经细胞凋亡水平来实现的。

关键词：脑缺血；肢体缺血后适应；凋亡；无创性

(ChinJLabDiagn,2016,20:0700)

由于远隔缺血后适应可以通过对肢体等不重要部位进行干预，具有事后性，具有较好的临床应用前景，成为近年研究的热点。已有研究表明远隔缺血后适应能对心肌[1]、肾脏[2]、骨骼肌[3]及脑[4]产生缺血保护作用，但尚无定论。本文通过制备大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)线栓模型，初步探讨无创性远隔肢体缺血后适应(remote ischemic postconditioning，RPC)是否对大鼠急性期脑缺血损伤具有保护作用，并探讨其机制。

1材料与方法

1.1主要试剂

主要试剂：Hs-CRP多克隆抗体，购自北京博奥森生物有限公司；细胞凋亡检测试剂盒，购自北京博奥森生物有限公司；多聚甲醛，购自天津市奥淇医科医药销售有限公司；10%水和氯醛，购自天津欧博凯化工有限公司。

1.2实验动物及分组

SPF级成年健康雄性SD大鼠54只，体重260-280 g，购买于北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物使用许可证编号：SCXK(京)2009-0004。采用抽签法将大鼠随机分为3组，每组18只：(1)假手术组(sham组)：单纯暴露颈部血管，不行缺血操作，不给予后适应干预。(2)缺血2 h再灌注组(I/R组)：大鼠MCAO 2 h进行长时间再灌注。(3)无创性肢体缺血后适应组(RPC)：大鼠MCAO 2 h后于鱼线拔出的同时立即给予无创性远隔肢体缺血后适应。

1.3实验方法

1.3.1动物模型制作对Longa线栓法[5]进行改良建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。判定模型：动物麻药失效苏醒后出现Horner征(缺血侧出现眼睑闭合、同侧眼球下陷等)和左侧肢体瘫痪的症状。死亡动物及造模不成功的大鼠重新造模保证每组大鼠数量不变。

1.3.2无创性肢体缺血后适应干预方法用止血带结扎大鼠双侧下肢根部结扎10 min、放松10 min，进行3个循环，以不能触摸到股动脉搏动为结扎股动脉缺血成功。

1.4观测指标

3组大鼠于MCAO模型建立后缺血2 h再灌注24 h后按Zea-Longa[5]等级评分法行神经功能评分，然后处死大鼠，采用TUNEL法测凋亡细胞水平，干湿称重法检测脑含水量，HE染色光镜观察细胞形态学，TTC染色法、数码相机拍照、Adobe PhotoShop CS软件分析、计算脑梗死体积。

1.5统计学方法

2结果

2.13组大鼠神经功能缺损的比较Sham组未见到神经功能受损，I/R组与Sham组组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；RPC组与I/R组比较，评分降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1　3组大鼠神经功能缺损评分的比较±s)

注：与Sham组比较，#P<0.05；与I/R组比较，*P<0.05。

2.23组大鼠局灶性脑缺血后脑水含量的比较局灶性脑缺血再灌注后I/R组和RPC组脑组织的含水量较Sham组都明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；但与I/R组比较，RPC组脑组织的水含量明显少，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2　3组大鼠脑缺血再灌注后脑水含量的比较±s)

注：与Sham组比较，#P<0.05；与I/R组比较，*P<0.05。

2.33组大鼠局灶性脑缺血后梗死体积的比较Sham组的脑梗死体积为0，与I/R组的脑梗死体积比较，RPC组脑梗死体积减少，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表2　3组大鼠TTC染色脑梗死体积的比较

注：与Sham组比较，#P<0.05；与I/R组比较，*P<0.05。

2.43组大鼠HE染色法光镜下海马CA1区细胞退变神经元数量的比较与Sham组比较I/R组的退变神经元数量最多，RPC组与I/R组比较，锥体细胞损伤明显减轻，退变神经元数量减少，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4　　　3组大鼠HE染色海马CA1区细胞退变神经元数的

注：与Sham组比较，#P<0.05；与I/R组比较，*P<0.05。

2.53组大鼠TUNEL法检测海马CAI区神经元凋亡数量的比较与Sham组比较，I/R组的凋亡细胞阳性数量最多，RPC组与I/R组比较，凋亡细胞阳性数量减少，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5　　　3组大鼠TUNEL法检测海马CAI区神经元凋亡的

注：与Sham组比较，#P<0.05；与I/R组比较，*P<0.05。

3讨论

已有研究证实缺血后适应[6]也能产生缺血耐受，但要使已缺血区域的脑组织原位再缺血来触发缺血后适应，临床应用显然不现实。尤其是大脑对缺血的敏感性及神经系统缺血后不可逆的损伤，患者难以接受，临床医生难以操作，使得脑组织原位缺血后适应的研究不能用于临床。远隔缺血后适应[7]是指器官缺血后，对远隔器官进行短暂的轻度的缺血再通，可起到保护作用。四肢由于对缺血耐受性强，容易实施缺血适应操作，对四肢进行短暂缺血再灌注[12]来探讨对脑缺血保护是一种比较安全有效的治疗措施。基于此我们通过无创性间断性阻断大鼠双侧股动脉缺血刺激，观察无创性远隔肢体缺血后适应是否能够增强脑对缺血再灌注损伤的抵抗能力，为临床救治缺血性脑血管病提供新的思路和手段。

由于SD大鼠脑血管解剖和生理功能与人类高度相似，所以我们在实验中利用Longa改良线栓法建立了稳定的大鼠大脑中动脉模型。采用无创性远隔缺血后适应(止血带短暂阻断双侧下肢血流10 min/10 min、3个循环)的方法进行研究，3组大鼠均于再灌注后24 h处死，从神经行为学、脑水肿程度、HE染色病理改变、神经元凋亡水平及炎症反应等方面进行了研究比较。目前关于此方面的研究尚存有争议，如2007年，Zhao等[8]研究认为缺血后适应可以保护全脑缺血动物海马CAI区的神经元，但不能改善其神经行为学测试情况，并说明尽管梗死体积减少但并不意味着神经功能改善。但王贝娜等[9]采用短暂肢体缺血后适应，发现可以显著改善神经功能。同期，王丽华等[10]对远程缺血后适应进行研究发现NIHSS评分明显改善。我们的研究证实了无创性远隔缺血后适应组与缺血再灌注组比较可以明显减少脑缺血侧脑梗死体积，减轻脑水肿，同时改善神经功能评分，对急性脑缺血具有保护作用。关于其脑保护作用的机制我们从凋亡方面进行了进一步研究。

细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程。Zhao等[8]在大鼠局灶性缺血模型中，发现缺血后处理能显著减少缺血半暗带区凋亡细胞的数量。Xing等[11]发现缺血后适应通过抑制凋亡，保护神经元免受缺血再灌注损伤。我们在实验中通过HE染色发现缺血再灌注组海马CAI区神经元均失去正常结构，细胞排列松散，结构紊乱，锥体细胞明显减少，可观察到大量退变神经元。而无创性远隔缺血后适应组与之比较凋亡细胞数减少，程度有所减轻。同时通过TUNEL染色发现缺血再灌注组海马CAI区神经元锥体细胞发生萎缩、结构破坏，细胞浆出现深染、空泡损害，细胞核出现固缩、碎裂、溶解，可见到典型的凋亡小体。而无创性远隔缺血后适应组与之比较神经元细胞损伤程度均明显减轻，凋亡神经元数也显著降低。提示无创性远隔缺血后适应通过抑制神经元凋亡发挥神经保护作用。

本实验证实了无创性远隔肢体缺血后适应在缺血性脑血管病急性期具有神经保护作用，其机制可能是通过降低凋亡水平来实现的。由于其实施具有无创、易行、易接受性的优点，更容易实现基础研究向临床应用的转化，具有广泛的临床应用前景。

参考文献：

[1]oukogeorgakis SP,Williams R,Panagiotidou AT,et al.Transient limb ischemia induces remote preconditioning and remote postconditioning in humans by a KATP channel-dependentmechanism[J].Circulation,2007,116(10):1386.

[2]冷玉芳,姚爱军.肢体缺血后处理和肾脏缺血后处理对大鼠肾脏缺血-再灌注损伤的影响[J].临床麻醉学杂志,2009,25(11):974.

[3]Eberlin,Kyle R,McCormack,Michael C,Nguyen,John T,et al.Sequential Limb Ischemia Demonstrates Remote Postconditioning Protection of Murine Skeletal Muscle[J].Plastic and Reconstructive Surgery,2009,123(25):85.

[4]Wang Q,Zhang X F,Ding Q.Limb Remote Postconditioning Alleviates Cerebral Reperfusion Injury Through Reactive Oxygen Species-Mediated Inhibition of Delta Protein Kinase C in Rats[J].Anesthesia,2011,113(5):1180.

[5]Zea Longa Z,Weinsten PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84.

[6]Zhao ZQ,Corvera JS,Haikos ME,et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,285(10):579.

[7]Kerendi F,Kin H,Halkos ME,et al.Remote postconditioning.Brief renal ischemia and reperfusion applied before coronary artery reperfusion reduces myocardial infarct size via endogenous activation of adenosine receptors[J].Basic Res Cardiol,2005,100(5):404.

[8]Zhao H.The Protective Effeet of Isehemic Postconditioning Against Isehemic Injury:From the Heart to the Brain[J].J Neuroimmune Pharmaeol,2007,2(5):313.

[9]王贝娜,何龙泉,王玉.神经功能恢复作用的临床观察[J].中风与神经疾病杂志，2012,29(5):439.

[10]王丽华,王国辉,金玉玲,等.远程肢体缺血后处理对急性脑梗死患者血清BDNF含量及神经功能评分影响[J] .黑龙江医药科学,2012,35(5):64.

[11]Xing B,Chen H,Zhang M,et al.Ischemic post-conditioning protects brain and reduces inflammation in a rat model of focal cerebral ischemia/reperfusion[J].Neurochem,2008，105(5):1737.

Noninvasive limb ischemic remote postconditioning effects on acute cerebral ischemia in rats

CHANGLi-sha,ZHANGYun-he,PENGYan-bo,etal.

(NorthChinaUniversityofScienceandTechnologyAffiliatedHospitalofNeurologyIIWardandNeurosurgery,Tangshan063000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism on acute cerebral ischemia in rats noninvasive limb ischemic remote post.Methods54 male SD rats were randomly divided into 3 groups,18 rats in each group.Sham operation group(Sham group),ischemia reperfusion group (I/R group)and distant limb ischemic postconditioning group(RPC group).Comparison of 3 groups of rats neural function deficit score,cerebral water content,the volume of cerebral infarction,CA1 area of hippocampus cell morphological changes and cell apoptosis level.ResultsCompared with I/R group,RPC group,cerebral ischemia reperfusion injury is reduced,nerve deficit score decreased,the brain water content and reduce the volume of cerebral infarction,reduce the damage of pyramidal cells,degeneration of neurons decreased significantly,lower level of apoptosis.The difference was statistically significant.(P<0.05).ConclusionNoninvasive limb ischemic remote postconditioning has neuroprotective effects on ischemic cerebrovascular disease at acute stage.The mechanism is probably by decreasing the level of apoptosis of neural cells to achieve.

Key words:cerebral ischemia;limb ischemic postconditioning;apoptosis;noninvasive

文章编号：1007-4287(2016)05-0700-04

中图分类号：R743.32

文献标识码：A

作者简介：常莉莎(1975-)，女，博士研究生，副主任医师，副教授，研究方向：脑血管疾病。

(收稿日期：2015-06-15)