葛根素对糖尿病大鼠视网膜中IGF-1和TNF-α表达的影响

杨　丽，常笑语，石　搏

(1.吉林大学第二医院 眼科，吉林 长春130041；2.吉林大学白求恩医学部临床医学院2012届；3.吉林大学基础医学院 实验中心)



*通讯作者

葛根素对糖尿病大鼠视网膜中IGF-1和TNF-α表达的影响

杨丽1，常笑语2，石搏3*

(1.吉林大学第二医院 眼科，吉林 长春130041；2.吉林大学白求恩医学部临床医学院2012届；3.吉林大学基础医学院 实验中心)

摘要：目的探讨不同剂量葛根素对糖尿病大鼠视网膜中IGF-1和TNF-α表达的影响。方法将90只健康清洁级Wistar雄性大鼠随机分为5组，分别为对照组(10只)、糖尿病模型组(20只)、葛根素2 mg/kg给药组(A组，n=20只)、葛根素5 mg/kg给药组(B组，n=20只)和葛根素10 mg/kg给药组(C组，n=20只)。除对照组外，其它4组均腹腔注射50 mg/kg链脲佐菌素制备糖尿病模型；给药方式均采用每日上午灌胃1次，3个月后处死，取各组大鼠眼球视网膜。采用HE染色检测大鼠视网膜的病理改变；采用免疫组织化学方法检测大鼠视网膜组织中IGF-1、TNF-α的蛋白阳性表达强度。结果与对照组相比较，糖尿病组和A组IGF-1蛋白的阳性表达强度均明显降低、TNF-α蛋白的阳性表达强度均明显升高，差异显著有统计学意义(P<0.01)；B组IGF-1蛋白的阳性表达强度降低、TNF-α蛋白的阳性表达强度升高，差异亦有统计学意义(P<0.05)；C组IGF-1、TNF-α蛋白的阳性表达强度略降低及略升高，差异无统计学意义(P>0.05)。与糖尿病组比较，A组差异无统计学意义(P>0.05)；B组、C组差异均有统计学意义(P<0.01)。结论葛根素能够通过提高IGF-1的表达及降低TNF-α的表达，从而起到保护视网膜的功能。

关键词：糖尿病；葛根素；视网膜；IGF-1；TNF-α；免疫组织化学

(ChinJLabDiagn,2016,20:0697)

糖尿病微血管并发症中最常见及最为严重之一是糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinoathy，DR)，它是一类细胞增殖性疾病，通常其发病机制与细胞增殖的调控失常有关[1]。近年来的研究发现，已有多种细胞因子参与了糖尿病微血管并发症DR发生、发展机制的调控，其发病机制的研究也日益受到关注。本实验选用IGF-1、TNF-α变化作为指标，探讨糖尿病大鼠 IGF-1、TNF-α的变化及其在DR发病机制中的重要作用，为葛根素广泛应用于糖尿病并发症的预防和治疗提供基础实验依据。

1材料与方法

1.1实验动物分组及给药方式购买吉林大学白求恩医学部动物实验中心 (动物许可号:SCXK2007-吉大-0003)健康清洁级Wistar雄性大鼠90只，体重为240-260 g，随机分为5组，分别为对照组(10只)、糖尿病模型组(20只)、葛根素2 mg/kg给药组(A组，n=20只)、葛根素5 mg/kg给药组(B组，n=20只)和葛根素10 mg/kg给药组(C组，n=20只)。除对照组外，其它4组均腹腔注射50 mg/kg链脲佐菌素制备糖尿病模型；给药方式均采用每日上午灌胃1次，3个月后处死，取各组大鼠眼球视网膜。

1.2实验试剂和实验设备葛根素购于南京正大天晴制药公司(纯度为99.8%)，用生理盐水稀释至实验所需浓度备用；链脲佐菌素(STZ，纯度100%，美国Sigma公司，配制成10 mg/ml链脲佐菌素溶液)；兔抗鼠IGF-1、TNF-α抗体均购于北京博奥森生物有限公司；SP9710和DAB试剂盒均购于福州迈新生物有限公司。Leica RM 2245石蜡切片机(德国Leica公司)，Leica EG 1150H包埋机(德国Leica公司)，Leica HI 1210捞片机(德国Leica公司)。

1.3模型制备方法[2]清晨腹腔注射链脲佐菌素50 mg/kg；并于注射48 h后，清晨空腹取尾血测血糖，糖尿病模型复制成功的标准是血糖浓度大于16.7 mmol/L。

1.4检测指标

1.4.1各组大鼠视网膜的病理检测实验结束后次日清晨处死大鼠，每组各随机取10个眼球固定于4%多聚甲醛液中，常规石蜡包埋，切成5 μm，进行HE染色。

1.4.2各组大鼠视网膜的IGF-1和TNF-α蛋白阳性表达强度的检测切片3 μm 2张，分别通过SP法进行免疫组织化学IGF-1、TNF-α染色。

1.5统计学分析各组大鼠视网膜中IGF-1和TNF-α蛋白阳性表达强度(灰度值)均以平均值±标准差进行表示，采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，采用t检验，α=0.05。

2结果

2.1一般状态整个实验过程中记录各组大鼠体重、精神状态、毛皮的光泽度及反应的灵敏度。对照组的一般状态极佳；糖尿病组的一般状态较差；葛根素从大剂量组、中剂量组到小剂量组的一般状态从佳、较好至较差，但仍明显好于糖尿病组。

2.2各组大鼠视网膜的病理检测结果对照组大鼠视网膜的色素上皮层、视细胞层、双极细胞层和节细胞层均清晰可见，各层细胞排列规则、紧密无炎细胞浸润；与对照组比较，糖尿病组各层细胞排列略微紊乱、松散且细胞质淡染，无炎细胞浸润；葛根素A、B和C组各层细胞排列均较为紧密、规则未见炎细胞浸润。

2.3各组大鼠视网膜TNF-α和IGF-1蛋白的阳性表达强度比较 免疫组织化学染色定性检测TNF-α和IGF-1蛋白的阳性表达强度，应用Motic Images Advanced 3.2图像分析软件半定量检测TNF-α和IGF-1蛋白阳性表达强度的灰度值，灰度值越大蛋白阳性表达越弱，灰度值越小蛋白阳性表达越强。与对照组相比较，糖尿病组和A组IGF-1蛋白的阳性表达强度均明显降低、TNF-α蛋白的阳性表达强度均明显升高，差异显著有统计学意义(P<0.01)；B组IGF-1蛋白的阳性表达强度降低、TNF-α蛋白的阳性表达强度升高，差异亦有统计学意义(P<0.05)；C组IGF-1、TNF-α蛋白的阳性表达强度略降低及略升高，差异无统计学意义(P >0.05)。与糖尿病组比较，A组差异无统计学意义(P>0.05)；B组、C组差异均有统计学意义(P<0.01)；见表1和图1、2。

表1　　　葛根素对各组大鼠视网膜TNF-α和IGF-1

注：aP<0.01,bP<0.05与对照组比较;cP<0.01与糖尿病组比较;dP<0.01与小剂量组比较;eP<0.01与中剂量组比较。

3讨论

随着人民生活水平的日益提高，糖尿病已经成为一种新的流行性疾病，而糖尿病严重且常见的微血管并发症之一是糖尿病性视网膜病变(Diabetic RetinoPathy，DR)，DR也是导致失明的一个重要因素[3]。近年来许多学者[4]对细胞因子与DR发生发展的关系进行了研究。本实验研究通过检测糖尿病大鼠视网膜中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和胰岛素样生长因子-1 ( insulin-like growthfactor-1，IGF-1)蛋白阳性表达强度，探究二者在DR发病中的作用机制。TNF-α是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，是一种重要的生物活性因子，它一方面能提高靶细胞对VEGF、TGF-β 以及IGF-1的反应性，从而促进新生的毛细血管及成纤维组织增生；另一方面能增加血管通透性，刺激血管内皮细胞增生，从而加速血管的新生[5]。IGF-1是细胞增殖调控因子，在细胞的增殖、分化及个体的生长发育中具有多功能调节作用；它是一种多肽类因子具有胰岛素样作用，糖尿病患者的胰岛素水平低下，导致血糖升高从而抑制了肝脏合成IGF-1，导致引起IGF-1减少，促进细胞的增生和分化，从而抑制视网膜内皮细胞的凋亡[6]。

图1各组大鼠视网膜TNF-α的病理学改变(免疫组化 ×400； A：对照组；B:葛根素大剂量组；C:葛根素中剂量组；D：葛根素小剂量组；E：模型组)

图2各组大鼠视网膜IGF-1的病理学改变(免疫组化 ×400； A：对照组；B:葛根素大剂量组；C:葛根素中剂量组；D：葛根素小剂量组；E：模型组)

目前已经证实，糖尿病状态下大鼠视网膜氧化应激加剧，导致生长增殖加速同时细胞凋亡受到抑制，使得视网膜毛细血管内皮细胞过度增殖，促进毛细血管的不断新生，因此导致视网膜病变的发生[7]。本实验研究结果表明，给予不同剂量的葛根素治疗后，能够提高IGF-1蛋白表达水平，降低TNF-α的蛋白表达水平，且随剂量的增加作用增强，差异有统计学意义；与糖尿病组比较，葛根素小剂量组差异无统计学意义；葛根素中、大剂量组差异均有统计学意义。提示葛根素能够通过提高IGF-1的表达及降低TNF-α的表达，调控视网膜病变的发生发展，从而起到保护视网膜的功能，为葛根素的临床应用奠定实验基础。

参考文献：

[1]陈雨,朱晓华.糖尿病视网膜病变发病机制的研究进展[J].国际眼科杂志,2006,6(2):433.

[2]杨怀中,王莉,廖国清,等.链尿佐菌素致糖尿病大鼠骨髓EPO、SCF浓度[J].中国老年学杂志,2008,16(2):101.

[3]徐萍.糖尿病视网膜病变的相关因素分析[J].国际眼科杂志，2009,8(3):501.

[4]王玚,邱波.糖尿病视网膜病变相关细胞因子的研究进展[J].国际眼科纵览,2010,34(4):416.

[5]吴波,韩萍.2型糖尿病患者血清IGF-1、TNF-α 与视网膜病变的关系[J].中国免疫学杂志，2005,21(6):123.

[6]Rosa Burgos,Crlos Maeo,et al.Vireous levels of IGF-1 binding protein in poliferative diabetic retimopthy[J].Diabet Care,2000,23(1):80.

[7]何皓,李传辉,金成吉,等.血管内皮生长因子基因多态性与糖尿病视网膜病变相关性[J].中国老年学杂志,2009,29(3):347.

The influence of puerarin on the expression of IGF-1 and TNF- α in retina in diabetic rats

YANGLi，CHANGXiao-yu，SHIBo.

(DepartmentofOphthalmology,TheSecondHospitalofJilinUniversity，Changchun130041，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Puerarin on the expression of different doses of IGF-1 and TNF-α in retina in diabetic rats.Methods90 healthy clean grade Wistar male rats were randomly divided into 5 groups,which were control group (10 rats),diabetic model group (20 rats),puerarin 2 mg/kg gives the medicine group (A group,n=20 only),puerarin 5 mg/kg gives the medicine group (B group,n=20 only) and puerarin 10 mg/kg the drug group (group C,n=20).Except the control group,diabetic model of inhibin preparation of other 4 groups were injected 50 mg/kg STZ;Administration methods were adopted in the morning,1 times in the morning,3 months later,the rats were sacrificed.HE staining was used to detect the rat retina pathological change;protein positive expression intensity of IGF-1,TNF-α immunohistochemical method was used to detect rat retinal tissues.ResultsCompared with the control group,diabetes group and a group of IGF-1 protein positive expression strength were significantly lower,TNF-α protein expression intensity was significantly higher,the differences of statistical significance(P<0.01),reduce the positive expression intensity of IGF-1 protein in group B and TNF-α protein positive expression intensity increased,the difference is also statistically significant (P<0.05),C group IGF-1,TNF-α protein expression intensity decreased slightly and slightly increased,the difference was not statistically significant(P>0.05).Compared with diabetic group,a group without statistical significance(P>0.05);B group and C group,the differences were statistically significant(P<0.01).ConclusionPuerarin can raise the expression of IGF-1 and decrease the expression of TNF-α,so as to protect the function of the retina.

Key words:diabetes mellitus;puerarin;retina;IGF-1;TNF-α;immunohistochemistry

基金项目：国家自然科学基金29890280-3(2)

文章编号：1007-4287(2016)05-0697-03

中图分类号：R587.1

文献标识码：A

(收稿日期：2015-12-14)