微波辅助提取金钗石斛多糖及体外抗氧化研究

邓维泽，古霞，闫天龙，李明元，，*，唐显福，杨文宇（.西华大学生物工程学院四川省食品生物技术重点实验室，四川成都60039；.贵州仙草生物科技有限公司，贵州赤水564700）



微波辅助提取金钗石斛多糖及体外抗氧化研究

邓维泽1，古霞1，闫天龙1，李明元1，2，*，唐显福2，杨文宇1
（1.西华大学生物工程学院四川省食品生物技术重点实验室，四川成都610039；2.贵州仙草生物科技有限公司，贵州赤水564700）

摘要：采用微波辅助提取金钗石斛多糖，通过单因素正交试验法考察料液比、提取功率、粉碎程度和辐射时间对金钗石斛多糖提取率的影响，确定其最佳提取条件；通过金钗石斛多糖对ABTS+自由基清除作用测定其体外抗氧化活性。结果表明：微波辅助提取金钗石斛多糖的最佳提取工艺条件为：料液比1∶20（g/mL），提取功率为400 W，粉碎程度60目，辐射时间为30 min，在此条件下多糖得率为3.16%。金钗石斛精制多糖对ABTS+自由基的清除率可达81.9%，表明其具有良好体外抗氧化作用。

关键词：金钗石斛多糖；微波辅助提取；工艺优化；正交试验；体外抗氧化

金钗石斛，又名金钗石，为兰科石斛属多年生附生草本植物［1］，是我国传统名贵中药。金钗石斛入药始载于《神农本草经》，被列为上品，因其生长在特殊的环境和具有强大的滋补功效而享有“民间仙草，植物黄金”的美誉。金钗石斛可“强阴益精，厚肠胃，状筋骨，暖水脏，补肾益力，轻身延年”，具有抗衰老、增强免疫力等功效［2-5］，其主要的功效成分是石斛碱及多糖类物质。金钗石斛是国家批准可用于保健食品的物品名单之一，其所含的石斛碱和石斛多糖决定了保健功能类别。目前，对于金钗石斛研究大多集中在石斛碱上，对于金钗石斛多糖提取工艺及其活性研究鲜见报道。本试验通过正交试验优化微波提取金钗石斛多糖工艺，并探究金钗石斛多糖体外抗氧化活性，为进一步金钗石斛多糖分离纯化及其活性的研究提供一定的基础，为金钗石斛多糖产品的研发提供一定的理论参考。

1　材料与方法

1.1材料

金钗石斛：贵州仙草生物科技有限公司提供，在实验室烘干、粉碎成40、50、60、70、80目等目数的试验材料备用；透析袋：成都奥克生物技术有限公司；活性炭：上海辉业化工科技有限公司。

1.2仪器与试剂

1.2.1主要仪器

UV2800紫外可见分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；MF-2270EG型微波炉：青海海尔制品有限公司；RE-52A型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；Alphal-2LD plus冷冻干燥机：德国CHRIST；DHG-9920A恒温鼓风干燥箱：品相科仪有限公司；HH-S8恒温水浴锅：金坛市华特实验仪器有限公司；FA/JA2104电子天平：常州宏衡电子仪器厂；OM-4A索式提取器：上海欧蒙实业有限公司；TG18G离心机：盐城市凯特实验仪器有限公司；BF-20粉碎机：石家庄本辰机电设备有限公司。

1.2.2主要试剂

ABTS自由基［2，2-azinobis-（3-ethylbenzthiazo line-6-sulfonate）］：购自美国Sigma公司；VC、过硫酸钾、石油醚、无水乙醇、丙酮、正丁醇、氯仿：均为分析纯。

1.3方法

1.3.1试验样品的前处理

称取金钗石斛干燥粉末，置于索氏提取器中，加入6倍体积石油醚80℃回流提取1 h，滤渣挥干溶剂，加入10倍体积80%乙醇，70℃回流提取2次，每次1 h，趁热抽滤，滤渣挥干溶剂，60℃干燥至恒重备用。

1.3.2金钗石斛粗多糖得率计算

金钗石斛粗多糖得率计算见公式（1）。

1.3.3金钗石斛多糖提取单因素试验

准确称取前处理干燥的金钗石斛粉10.0 g，放入500 mL的锥形瓶中，以水作为提取溶剂，在其他条件相同的情况下，采用不同的料液比、微波功率、物料粒度、辐射时间进行微波辅助提取试验，然后趁热过滤，减压浓缩，加入无水乙醇使溶液含乙醇至80%，静止过夜，离心得沉淀，真空冷冻干燥至恒重，称量。按照公式（1）计算金钗石斛粗多糖得率，逐个考察各提取条件对提取效果的影响，确定每一因素的最佳水平。

1.3.4金钗石斛多糖提取正交试验

根据1.3.3单因素试验结果，选取料液比、微波功率、物料粒度、辐射时间4个因素及3个最佳水平进行正交试验L9（34），微波辅助提取后趁热过滤，减压浓缩，加入无水乙醇使溶液含乙醇至80%，静止过夜，离心得沉淀，真空冷冻干燥至恒重，称量。按公式（1）计算金钗石斛粗多糖得率，确定金钗石斛多糖提取的最佳条件。

1.3.5金钗石斛精制多糖的制备

将金钗石斛粗制多糖加蒸馏水溶解，溶液用活性炭除色素，Sevage法除去蛋白质，反复操作直至紫外-可见光扫描无明显蛋白质吸收峰为止。用透析袋48 h流水透析，蒸馏水透析24 h，除去无机盐、小分子杂质及未除尽的色素，将透析袋内多糖液醇沉，离心得沉淀，用无水乙醇、丙酮各洗2遍，真空冷冻干燥至恒重即金钗石斛精制多糖［6-7］。

1.3.6金钗石斛多糖对ABTS+自由基清除率试验

精确称取一定量的金钗石斛粗多糖、金钗石斛精制多糖和VC，均配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL等5个浓度的待测液。金钗石斛多糖清除ABTS+自由基的试验分组、试验加样量及顺序见表1。

表1　金钗石斛多糖清除ABTS+自由基试验加样量及顺序Table 1 The test sample amount and order of Dendrobium nobile Lindl. Polysaccharides scavenging activity against ABTS+free radical

按照表1操作，分别计算金钗石斛粗多糖、金钗石斛精制多糖、VC对ABTS+自由基的清除率，清除率（P）的计算公式为：

式中：A0为空白组吸光度；Ai为样品组吸光度。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1料液比对多糖得率的影响

在微波功率300 W、辐射时间30 min、物料粒度40目的条件下，依1.3.3的试验方法，研究料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）时对多糖得率的影响，结果如图1所示。

图1　料液比对多糖得率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate extraction rate of polysccharides

由图1可知，当料液比大于1∶20（g/mL）时，金钗石斛多糖提取得率随料液比的减小而提高，当料液比小于1∶20（g/mL）时，金钗石斛多糖提取率随料液比继续减小，金钗石斛多糖提取率基本不变，从试验条件和后期处理成本出发，选择1∶20（g/mL）为最佳料液比。

2.1.2微波提取功率对多糖得率的影响

在料液比1∶20（g/mL）、辐射时间30 min、物料粒度40目的条件下，依1.3.3的试验方法，研究微波提取功率为100、200、300、400、500 W时对多糖得率的影响，结果如图2所示。

图2　微波提取功率对多糖得率的影响Fig.2 Effect of microwave power on of polysccharides extraction rate of polysccharides

由图2可知，金钗石斛多糖提取得率随着微波提取功率增大而提高，这主要是由于辐射时间一定，辐射功率越高，物质吸收微波能越多，对物质细胞的破换作用越大，有利于有效成分浸出，但是当微波功率过高时，瞬间加热作用会使液体沸腾溢出，反而影响多糖提取得率，不利于试验的进行。因此选择400 W为最佳微波提取功率。

2.1.3辐射时间对多糖得率的影响

在料液比1∶20（g/mL）、微波提取功率400 W、物料粒度40目的条件，依1.3.3的试验方法，研究辐射时间为10、20、30、40、50 min时对多糖得率的影响，结果如图3所示。

图3　辐射时间对多糖得率的影响Fig.3 Effect of radiation time on extraction rate of polysccharides

由图3可知，辐射时间在40 min之前，随着时间的增加，多糖提取得率逐渐升高，但当时间超过40 min时，金钗石斛多糖提取得率反而出现有所下降的趋势，这可能是由于溶解度达到饱和，有效成分不在被溶解，多糖产生降解现象［8-9］。因此，最佳辐射时间选择40 min。

2.1.4物料粒度对多糖得率的影响

在料液比1∶20（g/mL）、微波提取功率400 W、辐射时间40 min的条件，依1.3.3的试验方法，研究物料粒度为40、50、60、70、80目时对多糖得率的影响，结果如图4所示。

图4　物料粒度对多糖得率的影响Fig.4 Effect of material diameter on extraction rate of polysccharides

由图4可知，随着物料粒度目数的增大，金钗石斛多糖提取得率逐渐增大，当物料粒度目数达到60目以后，多糖提取得率随目数的增大基本不变，这可能是有效成分溶出已达饱和。

2.2正交试验结果

金钗石斛多糖提取效果受多个因素的交叉影响，上述试验只是单因素影响，为了确定在提取过程中这4个因素对金钗石斛多糖提取效果的影响大小，选出最佳的提取条件。依“1.3.4”的试验方法，正交试验设计见表2，正交试验结果见表3所示。

由表3可知，从极差R的大小可以看出影响金钗石斛多糖提取的4个因素的主次关系是：微波功率＞辐射时间＞物料粒度＞料液比。因素C的极差很小，所以将此列作为方差分析的误差列［10］，结果见表4。

表2　正交试验四因素三水平L9（34）表Table 2 Four factors and three levels of L9（34）of orthogonal test

表3　正交试验结果的直观分析表Table 3 Visual analysis of orthogonal test result

表4　方差分析表Table 4 Analysis of variance table

F检验表明，B因素（微波功率）P＜0.01，D因素（辐射时间）P＜0.05，说明在B因素所设的不同水平下对金钗石斛提取效果有极显著性差异，在D因素所设不同水平下有显著性差异，其他因素各水平间差异均不显著。

从表3中k值所得，正交试验最优水平组合为A2B2C2D2，即微波辅助提取金钗石斛多糖最佳工艺条件为：物料粒度60目，微波提取功率为400 W，料液比为1∶20（g/mL），辐射时间为30 min。

按以上最佳条件进行了验证试验，所得金钗石斛多糖得率为3.16%，比正交试验中的最高金钗石斛多糖得率3.05%提高了0.11%。

2.3金钗石斛多糖对ABTS+自由基清除作用

ABTS+自由基清除法常用于评估生物样品总抗氧化能力［11-12］。在反应体系中，ABTS+经氧化后生成相对稳定的蓝绿色ABTS+水溶性自由基，抗氧化剂与ABTS+自由基反应后使其溶液褪色，特征吸光值降低，溶液退色越明显则表明所检测物质的总抗氧化能力越强。金钗石斛多糖及VC对ABTS+自由基的清除作用见图5。

图5　金钗石斛多糖及VC对ABTS+自由基的清除作用Fig.5 Comparison of ABTS+free adical scavenging capacity between Dendrobium nobile Lindl. polysaccharides and VC

由图5可知，在质量浓度0.5 mg/mL～2.5 mg/mL范围内，随着VC浓度的增加，VC对ABTS+自由基清除率逐渐增加，在2.5 mg/mL时达到93.8%；金钗石斛精制多糖和粗多糖在试验浓度范围，随着质量浓度的增加，他们对ABTS+自由基的清除率逐渐增加，精制多糖对ABTS+自由基的清除率最高可以达到81.9%，接近VC对ABTS+自由基的清除率，粗多糖对ABTS+自由基的清除率最高可达到44.3%。总体上，清除ABTS+自由基的能力大小是VC＞精制多糖＞粗多糖。

3　结论与讨论

1）本试验通过单因素及正交试验得出了微波辅助提取金钗石斛多糖的最佳提取工艺条件为：物料粒度60目，微波提取功率400 W，料液比为1∶20（g/mL），辐射时间30 min。在此条件下金钗石斛多糖的提取得率达3.16%，各个因素对金钗石斛多糖得率的影响作用大小顺序依次为微波提取功率＞辐射时间＞物料粒度＞料液比，这为金钗石斛多糖的深入研究及开发为相关的产品提供一定的理论参考。

2）金钗石斛多糖表现出良好的清除ABTS+自由基的能力，特别是金钗石斛精制多糖对ABTS+自由基的清除率可达81.9%，接近VC对ABTS+自由基的清除率，是一种潜在的新型抗氧化剂。

参考文献：

［1］王康正，高文远.石斛属药用植物研究进展［J］.中草药，1997，28（10）：633-635

［2］吉占和.中国石斛属植物的初步研究［J］.植物分类学报，1980，18 （4）：427-449

［3］张纪立，何锦丽.石斛药理研究进展［J］.时珍国医国药，2000，11（5）：469-470

［4］黄玲，施红，章小宛，等.水提和醇提的石斛口服液对衰老药效学指标的影响［J］.福建中医学院学报，1996，6（3）：27

［5］陈晓梅，郭顺星.石斛属植物化学成分和药理作用的研究进展［J］.天然产物研究与开发，2001，13（1）：70-75

［6］陈志国，叶松山，范迎，等.金钗石斛多糖提取工艺的优化及其对小鼠脾细胞增殖的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（15）：28 ［7］杨颖，孙文武，周晨，等.响应曲面法优化玉竹水溶性多糖提取及体外抗氧化研究［J］.食品与生物技术学报，2013，32（3）：200-203

［8］王莉，陈正行，张潇艳.微波辅助提取米糠多糖的工艺［J］.江苏大学学报（自然科学版），2007，28（3）：194-195

［9］先桂花，李滨，臧恒昌.微波辅助提取霍山石斛多糖的研究［J］.农业科学与技术（英文版），2014，15（8）：1304-1307

［10］王钦德，杨坚，明道绪.食品试验设计与统计分析［M］.北京：中国农业大学出版社，2010：116-117

［11］Miller N J，Sampson J，Candeias L P，et al. Antioxidant activities of carotenes and xanthophylls［J］.FEBS Letters，1996，384：240-242

［12］V Katalinic，M Milos，T Kulisic，et al.Screening of 70medicinal plant extracts for antioxidant capacity and total phenols［J］. Food Chemistry，2006，94：550-557

Microwave-assisted Extraction and in Vitro Antioxidant Activity Evaluation of Polysaccharides from Dendrobium nobile Lindl.

DENG Wei-ze1，GU Xia1，YAN Tian-long1，LI Ming-yuan1，2，*，TANG Xian-fu2，YANG Wen-yu1
（1. Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan，College of Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，Sichuan，China；2. Xian Cao Biological Technology Co.，Ltd.，Chishui 564700，Guizhou，China）

Abstract：Crude polysaccharides were extracted from Dendrobium nobile Lindl. by microwave-assisted. Optimal extraction conditions were explored to evaluate the effects of solvent to material ratio，extraction power，material diameter and extraction time on extraction rate of polysaccharides through single factor orthogonal test method. Dendrobium nobile Lindl. polysaccharides in vitro antioxidant activity were measured by its scavenging effect on ABTS+free radical. The results showed that the optimal microwave-assisted extraction conditions of polysaccharides from Dendrobium nobile Lindl. were the material-liquid ratio of 1∶20（g/mL），the extraction power of 400 W，the extraction material diameter of 60 mesh and the extraction time of 30 min. Under the optimal extraction conditions，the extraction rate of polysaccharides was up to 3.16%. Dendrobium nobile Lindl. refined polysaccharides on the clearance rate of ABTS+free radical could reach 81.9%.Therefore，the polysaccharides from Dendrobium nobile Lindl. have strong antioxidant activity in vitro.

Key words：Dendrobium nobile Lindl. polysaccharides；microwave-assisted extraction；process optimization；orthogonal test；antioxidant in vitro

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.013

基金项目：贵州省遵义市中药重大专项赤中药科合（201306）

作者简介：邓维泽（1988—），男（汉），硕士研究生，研究方向：食品营养保健。

*通信作者

收稿日期：2015-03-12