复合蛋白酶提高谷朊粉溶解度的研究

邱斌，付博菲，2，徐同成，孙文佳，杜方岭，*（．山东省农业科学院农产品研究所，山东济南25000；2.天津师范大学，天津300387）



复合蛋白酶提高谷朊粉溶解度的研究

邱斌1，付博菲1，2，徐同成1，孙文佳1，杜方岭1，*
（1．山东省农业科学院农产品研究所，山东济南250100；2.天津师范大学，天津300387）

摘要：利用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶和复合蛋白酶分别水解谷朊粉，发现复合蛋白酶水解谷朊粉水解度较大，水解后分子量较小，且后续蛋白回收率较大，因此选用复合蛋白酶作为后续谷朊粉改性用酶。

关键词：谷朊粉；溶解度；蛋白酶；筛选

目前常用于水解蛋白的蛋白酶主要类型有：1、动物来源的蛋白酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶；2、植物来源的蛋白酶，如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶；3、微生物来源的蛋白酶，如枯草芽孢杆菌、青霉、曲霉中产生的酶。不同类型的酶对水解谷朊粉的能力不同，从而对后续提高其乳化性能的能力也不同，因此本研究主要探究不同酶水解谷朊粉的程度，从常用的水解酶中筛选出一种较优的，对探究酶法改性谷朊粉提高其溶解性是很有必要的。

1　材料与方法

1.1原料与试剂

市售谷朊粉：泰裕麦业有限公司；中性蛋白酶：Solarbio公司；碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶、复合蛋白酶：Solarbio公司；牛血清蛋白：生工生物。

1.2试验仪器

pH211酸度计：HANNA instrument；T25匀浆机：德国IKA公司；79-1磁力搅拌器：金坛市鸿科仪器厂；pk-8D电热恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司；CR22D高速冷冻离心机：日本HITACHI公司；UV160紫外分光光度计：日本岛津公司。

1.3方法

1.3.1谷朊粉基本组成测定

水分测定：105℃烘箱法，GB 5749-2006《生活饮用水卫生标准》。

粗蛋白测定：微量凯氏定氮法GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》，蛋白系数为5.7。

1.3.2不同蛋白酶水解谷朊粉

5种不同的蛋白酶分别水解谷朊粉，最优水解反应条件见表1。将谷朊粉配置成5%的溶液，加入按酶活一定加入一定量的蛋白酶，设定测定水解度的时间段，按照预定的时间测定水解度，达到预定的最长时间时停止调节pH，将溶液置于98℃的水浴中加热10 min灭酶后，冷冻干燥备用［1］。

表1　不同蛋白酶水解谷朊粉的最优条件Table 1 Conditions for the hydrolysis of wheat gluten with different proteases

1.3.3中碱性条件水解度的测定

蛋白质水解度（DH），是指蛋白质水解反应过程中单位质量中肽键断裂数占总数的比例。中碱性条件下通常采用pH-Stat法，计算公式如下［2］：

式中：V为NaOH溶液消耗体积，mL；N为NaOH溶液浓度，mol/L；M为谷朊粉质量，g；H为每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数（毫克当量/每克蛋白质），谷朊粉取值8.38；T为温度，℃；α为氨基的平均解离度；pH为水解溶液的pH值；pKa为α-氨基的解离度的负对数。

1.3.4蛋白回收率测定

蛋白质回收率测定参考Fonkwe等［3］，蛋白质含量测定方法参考1.3.1。

1.3.5可溶性蛋白的测定

测定谷朊粉溶解度采用双缩脲法［4］：

配制蛋白标准液：将标准牛血清蛋白（BSA）配制成10 mg/mL的标准蛋白溶液，后用浓度为1 mg/mL BSA溶液的A280为0.66来矫正。

双缩脲试剂：称取1.50 g硫酸铜和6.0 g石酸钾钠，溶解于500 mL水中，不断搅拌，并加入300 mL 10% NaOH溶液，最终用水定容至1 000 mL后贮存于塑料瓶或内壁涂有石蜡的瓶中。

标准曲线的建立：取蛋白标准液20 mL，分别吸取0.0、0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL于试管中，用蒸馏水补足到1 mL，加入4 mL双缩脲试剂于540 nm处进行比色测定。以牛血清蛋白浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，作标准曲线。把待测蛋白的吸光度带入标准曲线，即可得到待测蛋白的溶解度值。蛋白质溶解度标准曲线见图1，相关系数达到0.999 6。

图1　牛血清蛋白标准曲线Fig.1 The standard curve of bovine serum albumin

1.3.6谷朊粉溶解性测定

采用分散系数表示［5］：

式中：C为被测蛋白质的浓度，参照2.3.5，mg/mL；V为被测蛋白质溶液的总体积，mL；W为蛋白质样品的总质量，mg。

1.3.7谷朊粉水解物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

一般情况下SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是采用不连续缓冲系统进行，样品中的SDS-多肽复合物在两极间电流接通后，被凝胶中形成的移动界面带动前进。本试验参照Laemmli方法［6］加以改进：

电泳缓冲液：125 mmol/L Tris 1.25 mol/L甘氨酸（电泳级）0.5%（m/v）电泳级SDS

可配制成5×贮存液，在900 mL去离子水中溶解15.1 g Tris和94 g甘氨酸，然后加入50 mL 10%（m/V）电泳级SDS的贮存液，用去离子水补至1 000 mL即可。

2×SDS凝胶上样缓冲液：1 mL 1mol/L Tris-HCl （pH6.8）+ 4 mL 10%SDS + 2 mL 1%溴酚蓝+ 2 mL甘油+ 1 mL去离子水。

分离胶和浓缩胶：分别配制20 mL分离胶、10 mL浓缩胶。分离胶和浓缩胶的组成见表2。

表2　分离胶和浓缩胶的组成Table 2 The constitutes of separation and stacking gel

点样完成之后，向两侧电泳槽中加入电极缓冲液，连通电源，启动机器。在电泳槽两端分别接上正负两极，初始电压80 V，电流20 mA，待样品进入分离胶时，电流控制在10 mA，电压控制在110 V。电泳过程中维持强度恒定，以样品到达全胶长的四分之三为止。

2　结果与讨论

2.1谷朊粉基本组成

测得原料谷朊粉的含水量是5.6%，粗蛋白含量是81.9%。

2.2不同蛋白酶水解谷朊粉水解度与时间的关系

控制蛋白质水解反应与蛋白质水解反应机理有关，包括可溶性酶和不可溶性酶作用底物［1］。如图2所示。

图2　不同蛋白酶水解谷朊粉水解度与时间的关系Fig.2 Enzymatic hydrolysis of wheat gluten with different proteases

风味蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶和复合蛋白酶分别水解谷朊粉，水解度变化趋势是先快后慢，最终保持稳定，不同蛋白酶达到最大水解度的时间不同。其中复合蛋白酶能够使谷朊粉水解到较大程度，中性蛋白酶和碱性蛋白酶次之，胃蛋白酶和风味蛋白酶相对较水解谷朊粉能力较弱。这可能是由于谷朊粉蛋白中各种氨基酸含量不同，不同蛋白酶的作用位点不同，使得酶切切点数量不同，影响水解作用的速度；随着反应进行，蛋白酶酶活力逐渐降低，导致蛋白酶水解能力逐渐减弱。

2.3不同水解度对谷朊粉水解物溶解性的影响

不同程度的水解度会导致水解物的溶解性不同，通过对5种酶在不同水解度梯度时溶解性的测定，如图3所示。

不同酶水解物到达最大溶解度的水解度不同，其中复合蛋白酶在水解度大概在12%时得到最大溶解度；碱性蛋白酶和风味蛋白酶到达最大溶解度的水解度也在12%左右，但较复合蛋白酶水解物的溶解度小；胃蛋白酶和风味蛋白酶水解后溶解度在水解度为4%左右时最大，但最大值较小。因此能够得出在水解度为0%～12%时，水解物溶解度随水解度增大而逐渐增大。

图3　不同水解度对谷朊粉水解物溶解性的影响Fig.3 The effect of different hydrolysis for the solubility profile of the wheat gluten hydrolysate

2.4谷朊粉水解物的溶解度

谷朊粉在中性条件下溶解度很差，但通过调节pH能够改善其溶解性。经不同酶水解后，在一定的pH范围内的溶解度变化不大，如图4所示。

图4　pH对酶解前后谷朊粉溶解度的影响Fig.4 Effect of pH on solubility profiles of WGHs and hydrolysate with different enzymes

这可能是由于酶解过程中产生了更多的具有亲水作用的小分子多肽，因此即使在pH到达等电点时，也对其无太大影响。

2.5谷朊粉水解物的蛋白回收率

不同蛋白酶水解谷朊粉后得到的蛋白质含量见表3。

表3　谷朊粉不同蛋白酶水解物的蛋白回收率Table 3 Protein recovery from different protease hydrolysate of wheat gluten

蛋白质回收率是一项非常重要的测定指标，它能够用于设计生产水解食用蛋白质的加工工艺中。影响蛋白回收率的因素有很多，其中影响作用最大的是蛋白酶使用的种类。复合蛋白酶水解谷朊粉得到的高回收率和低使用量为后续投入到规模化生产奠定了良好的基础。

2.6电泳分析

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳由连续系统和不连续系统构成，即分离胶的连续系统和浓缩胶与分离胶的不连续系统。在电泳过程中，样品首先从浓缩胶中通过，由于等速电泳现象在进入分离胶前就被浓缩。进入分离胶后，聚丙烯酰胺根据分子大小进行筛滤，小分子蛋白阻力小，很容易通过凝胶孔径，迁移速度快；大分子蛋白受到阻力较大而被滞后，最终在电泳过程中蛋白质能够根据各自分子量的大小而被分离。

为了探究不同蛋白酶对谷朊粉水解作用的影响，使用SDS-PAGE法分别得到不同蛋白酶水解产物的分子量。结果如图5所示。

图5　不同蛋白酶水解产物的SDS-PAGE图Fig.5 SDS-PAGE profile of WGHs obtained with different enzymes

从b泳道中能够看出复合蛋白酶水解物分子量大部分都在14.4 kDa一下；c和d泳道中水解物分子量还有部分集中在20.1 kDa～31.0 kDa，其余也在14.4kDa以下；e泳道中水解物分子量在43.0 kDa～14.4 kDa及 14.4 kDa以下均与分布；f泳道中水解物分子量主要集中在97.4 kDa～20.1 kDa。表明复合蛋白酶水解的较为充分，水解能力较优。

3　结论

1）分别采用复合蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶和风味蛋白酶对谷朊粉进行水解，发现随着水解时间的变化，水解度的变化趋势呈现先快后慢的增长态势，最终保持稳定，达到最优水解度的时间均不相同。

2）5种蛋白酶水解谷朊粉性能对比，复合蛋白酶水解谷朊粉水解度较大，水解后分子量较小，且后续蛋白回收率较大，因此选用复合蛋白酶作为后续谷朊粉改性用酶。

参考文献：

［1］Xiangzhen Kong，Huiming Zhou，Haifeng Qian. Enzymatic hydrolysis of wheat gluten by proteases and properties of the resulting hydrolysates［J］. Food Chemistry，2007（102）：759-763

［2］Adler-Nissen J. In enzymic hydrolysis of food proteins［M］. New York：Elsevier Applied Science Publisher，1986：263-313

［3］LGFonkwand RKSingh.Proteinrecoveryfrommechanically deboned turkey residue by enzymic hydrolysis［J］.Process Biochemistry，1996，31（6）：605-616

［4］杜长安，陈复生.植物蛋白工艺学［M］.北京：中国商业出版社，1995：55-60

［5］何慧.碱处理面筋蛋白功能性之探讨［J］.食品科学，1992，19（2）：241-252

［6］Bietz J A，Rothfus J A.Comparison of peptides from wheat gliadin and glutenin［J］. Cereal Chemistry，1970，47（4）：381-392

Studies on Screening Proteinase of Improving the Solubilitye of Wheat Gluten

QIU Bin1，FU Bo-fei1，2，XU Tong-cheng1，SUN Wen-jia1，DU Fang-ling1，*
（1. Institute of Agro-Food Science and Technology，Shandong Academy of Agricultural Science，Jinan 250100，Shandong，China；2. Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）

Abstract：Using the neutral protease，alkaline protease，flavor protease，pepsin and protemax protease to hydrolyze the wheat gluten separately，the following results showed：the the hydrolysis degree of wheat gluten hydrolyzed by protemax was bigger than hydrolyzed by others，the the molecular weight after hydrolyzed was smaller，and the subsequent protein recovery rate was bigger. Therefore the protemax was choosed as the subsequent modified enzyme for wheat gluten.

Key words：wheat gluten；solubility；proteinase；screen

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.004

基金项目：山东省引进泰山学者海外特聘专家项目（鲁财教［2012］45号）

作者简介：邱斌（1982—），男（汉），助理研究员，博士，主要从事粮油加工。

*通信作者：杜方岭（1972—），男（汉），硕士生导师，研究员。

收稿日期：2015-03-17