追风伞总黄酮的纤维素酶提取工艺研究

2016-06-13王庆薛天乐

长江大学学报(自科版) 2016年9期

关键词：光密度容量瓶黄酮

王庆,薛天乐

(亳州职业技术学院药学院，安徽亳州 236800)

追风伞总黄酮的纤维素酶提取工艺研究

王庆,薛天乐

(亳州职业技术学院药学院，安徽亳州 236800)

[摘要]采用紫外分光光度法，以芸香苷为标准品建立标准曲线,分别研究了酶用量、提取时间、料液比和提取温度对纤维素酶法提取追风伞(Lysimachia paridiformis)中总黄酮提取率的影响，再设计正交试验优选最优提取工艺。结果表明，其最优工艺条件为：酶用量4.0mg，提取时间2.5h，料液比1∶30，提取温度50℃。在最优提取工艺条件下，追风伞中的总黄酮提取率可达2.68%。因此，该方法可以用于追风伞总黄酮的提取。

[关键词]纤维素酶；追风伞(Lysimachia paridiformis)；总黄酮

报春花科珍珠菜属植物追风伞(Lysimachiaparidiformis)性辛、温，具有祛风、活血的功效，临床上主要用于风湿疼痛、半身不遂等的治疗[1,2]。追风伞黄酮类化合物含量丰富,但关于其提取工艺的研究很少。为此，笔者利用纤维素酶法提取追风伞总黄酮，以期为追风伞的二次开发提供支持。

1材料与方法

1.1材料、仪器与试剂

追风伞由安徽省亳州市三义堂药业有限公司提供；芸香苷为中国药品生物制品检定所产品；纤维素酶为湖南米纯生物科技有限责任公司产品。

旋转蒸发仪RE-205为上海予华仪器设备有限公司产品；水浴锅HH-4为金坛市普林仪器制造有限公司产品；紫外分光光度计UV2400为北京钮因科技有限公司产品。

1.2试验方法

1.2.1标准曲线的绘制

精确称取芸香苷标准品5.5mg置于小烧杯中，加70%乙醇溶解并转移至50mL容量瓶中，以70%乙醇稀释至刻度线，制成浓度为0.11mg/mL标准液[2]。取6支25mL容量瓶，分别编号为0、1、2、3、4、5，在上述容量瓶中依次加入芸香苷标准溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，然后分别加入1.0mL的5%NaNO2溶液，混匀，放置6min后，分别加入1.0 mL 10%Al(NO3)3溶液，混匀并放置6min，再分别向上述容量瓶中加入10.0mL 4%NaOH溶液，70%乙醇定容，混匀，15min后在510nm波长处分别测定光密度(以0号管为空白)。以芸香苷浓度为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准曲线(图1)。

1.2.2提取步骤及样品测定

将干燥的追风伞粉碎成粗粉，准确取追风伞粗粉1.5g置于100mL烧瓶中，按照设计方案，以不同工艺条件进行提取追风伞总黄酮。90℃水浴10min灭活纤维素酶，同法提取3次，合并提取液，减压浓缩，以70%的乙醇定容至50mL容量瓶中，得到总黄酮试液。取2.0mL总黄酮试液至25mL容量瓶中再测定各自的光密度，然后按照标准曲线方程计算，求得总黄酮提取率。

图1　芸香苷标准曲线图

1.2.3单因素试验

1)纤维素酶用量称取追风伞粗粉6份，每份1.5g，料液比1∶40(g/mL)，分别加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mg的纤维素酶用量，40℃条件下提取2h，再测定各自的光密度，然后按照标准曲线方程计算并比较总黄酮提取率。

2)提取时间称取追风伞粗粉6份，每份1.5g，料液比1∶40(g/mL)，纤维素酶4.0mg，在40℃条件下分别提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，再测定各自的光密度，然后按照标准曲线方程计算并比较总黄酮提取率。

3)液料比称取追风伞粗粉6份，每份1.5g，纤维素酶用量4.0mg，提取温度40℃，在液料比分别为1(1∶10)、2(1∶20)、3(1∶30)、4(1∶40)、5(1∶50)、6(1∶60)的条件下提取2h，再测定各自的光密度，然后按照标准曲线方程计算并比较总黄酮提取率。

4)提取温度称取追风伞粗粉6份，每份1.5g，料液比1∶40(g/mL)，纤维素酶用量4.0mg，分别在35、40、45、50、55、60℃的温度下提取2h，再测定各自的光密度，然后按照标准曲线方程计算并比较总黄酮提取率。

1.2.4正交试验

在单因素试验基础上，以总黄酮提取率为考察指标，选择酶用量、提取时间、料液比、提取温度4个相关因素进行正交试验，正交试验因素水平如表1所示。

表1　正交试验因素水平表

2结果与分析

2.1纤维素酶用量对总黄酮提取率的影响

图2　纤维素酶用量对追风伞总黄酮提取率的影响

由试验结果(图2)可知，当纤维素酶用量高于3.0mg时，总黄酮的提取率增速变缓；当纤维素酶用量高于4.0mg时，提取率几乎不变，表明此时酶解作用已经近似饱和。因此，当纤维素酶用量为3.0～5.0mg较为适宜。

2.2提取时间对总黄酮提取率的影响

由试验结果(图3)可知，追风伞总黄酮提取率随着提取时间的增加而提高，但是当提取时间超过2h时，总黄酮提取率增加不明显。综合考虑，提取时间以1.5～2.5h较为适宜。

2.3液料比对总黄酮提取率的影响

由试验结果(图4)可知，追风伞总黄酮提取率随溶剂的增加而增大，但当料液比超过1∶40后，总黄酮提取率增加不明显，这不仅造成试验原料浪费，也为后续的蒸发浓缩带来困难。综合考虑，料液比应为1∶40左右为宜。

图3 提取时间对追风伞总黄酮提取率的影响图4 料液比对追风伞总黄酮提取率的影响

图5　提取温度对追风伞总黄酮提取率的影响

2.4提取温度对总黄酮提取率的影响

由试验结果(图5)可知，在35℃到60℃之间时，追风伞总黄酮提取率随温度升高总体呈先升后降趋势，在50℃时总黄酮提取率最高，表明在50℃时纤维素酶活性最大，而温度高于50℃后追风伞总黄酮提取率有明显下降，这可能是因为高温抑制了酶的活性所致。

2.5纤维素酶法提取总黄酮的最优工艺条件

在单因素试验基础上，以酶用量、提取时间、料液比、提取温度4个相关因素进行正交试验，结果如表2所示。根据正交试验结果，可以确定最佳提取工艺是A2B3C1D2，即酶用量为4mg，提取时为2.5h，料液比1∶30，提取温度50℃。4个因素对追风伞总黄酮提取率影响的大小依次是：酶用量>提取温度>提取时间>料液比。在最佳工艺条件下，通过实验验证，追风伞总黄酮提取率可达2.68%，比文献[4]报道的乙醇回流法提高了58.6%。

表2　正交试验结果表

3结语

使用纤维素酶法提取追风伞中的总黄酮，利用酶制剂降解植物细胞壁，可显著增加细胞内有效成分溶出度，提取条件温和，操作简便，成本较低，且提取率显著高于乙醇回流法[5]。因此，该方法可用于追风伞总黄酮的提取。需要指出的是，使用纤维素酶法提取追风伞中总黄酮时，采用的溶剂为水，由于水本身极性较大，对极性较小的黄酮特别是黄酮苷元的溶解状况不佳。针对上述情况，可尝试使用乙醇作为提取溶剂，把酶提法和回流提取法、超声提取法和微波提取法等结合使用来提取追风伞总黄酮，以期获得更高的提取率[6～8]。

[参考文献]

[1]向秋玲.追风伞的化学成分研究[D].贵阳：贵州大学,2007.

[2]邱净英,徐必学,杨宁线,等.追风伞化学成分的研究[J].时珍国医国药,2009，(10):2393～2394.

[3]张圣燕,张成.纤维素酶提取冬枣叶中总黄酮工艺的研究[J].食品工业科技,2013，(1):188～190.

[4]叶敏,孔维兵,王小英.追风伞总黄酮提取工艺优选及其体外抗氧化作用考察[J].中国实验方剂学杂志，2013,19(1)：44～46.

[5]陶文亮,李慧力.酶法在植物黄酮提取中的应用[J].贵州化工，2010，(5):32～34.

[6]魏凤玉,王欣.纤维素酶-乙醇协同提取黄芩总黄酮[J].天然产物研究与开发，2014，(4)：575～578

[7]孟娜,魏胜华,陶玉贵,等.超声波-酶法联合提取绞股蓝总黄酮及其抗氧化活性的研究[J].食品工业科技.2014，(3)：138～141

[8]黄靖.纤维素酶-乙醇法提取苦丁茶中总黄酮[J].湖北农业科学,2012,(23)：5445～5447，5451.

[收稿日期]2016-01-12

[基金项目]安徽省高等学校自然科学重点项目(KJ2015A358)；亳州市中药科技创新团队项目(BZ2013zzb06)。

[作者简介]王庆(1982-)，女，硕士，讲师，主要从事天然药物活性成分分离纯化研究，84181713@qq.com。