iNOS和VEGF在子宫内膜异位症的表达*

李 燕，朱 君

(新疆医科大学第五附属医院，新疆 乌鲁木齐 830000)

iNOS和VEGF在子宫内膜异位症的表达*

李 燕，朱 君

(新疆医科大学第五附属医院，新疆 乌鲁木齐 830000)

摘 要:目的:研究诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、血管内皮生长因子(VEGF)在子宫内膜异位症(EMs)的异位内膜的表达。方法:采用免疫组织化学方法分别检测30例EMs异位内膜与35例正常对照组子宫内膜组织中iNOS、VEGF的表达，了解异位内膜组织中iNOS、VEGF表达的相关性。结果:在EMs的异位内膜组织中，iNOS和VEGF蛋白的表达明显高于正常子宫内膜组织的表达；在EMs异位子宫内膜组织中，iNOS和VEGF的表达成正相关(r= 0.895，P＜0.05)。结论:EMs中，异位内膜组织的侵袭力增强及血管生成可能与iNOS、VEGF高表达有关。

关键词:子宫内膜异位症； 诱导型一氧化氮合成酶； 血管内皮生长因子； 免疫组织化学

子宫内膜异位症(EMs)发生发展中，一氧化氮(Nitric oxide，NO)参与其中。NO的产生需要一氧化氮合酶(NOS)的催化作用，本研究取材于EMs患者异位内膜、在位内膜及其他妇科疾病的子宫内膜，采用免疫组织化学方法检测EMs组织中iNOS和VEGF的表达水平，研究EMs与NO及VEGF水平是否相关。

1 资料与方法

1.1研究对象:选取2012年2月至20013年10月新疆医科大学第五附属医院妇科住院患者，选择由科主任进行腹腔镜手术探查的子宫内膜异位症患者30例作为研究组，所有病例均根据手术所见及术后病理确诊，病理切片诊断处于月经周期的增生期18例，分泌期12例；患者年龄35～48岁；对照组选用因各种良性疾病在住院期间行腹腔镜下子宫全切术35例，术后病理切片诊断是正常子宫内膜，其中处于月经周期的增生期22例，分泌期13例；患者年龄38～51岁。研究组和对照组在患者的年龄、子宫内膜分期以及体重指数在统计学上无显著性差异，两组患者术前6个月内无口服性激素类药物史及宫内节育器放置术史。

1.2方 法

1.2.1免疫组化所用试剂:兔多克隆IgG抗体iNOS，兔抗人VEGF多克隆抗体，SP免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程公司，iNOS抗体稀释浓度1∶200，VEGF抗体稀释浓度为1:100。

1.2.2免疫组化检测:在手术中采集标本，即EMs的异位子宫内膜组织和正常子宫内膜，经甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，每张约4μm厚度，一式4份。l份制作HE染色切片，3份用做免疫组化试验。按试剂盒操作说明书进行，并且检测VEGF及iNOS在组织的分布，对照组用PBS代替一抗作阴性对照。

1.2.3免疫组化图像分析标准:采用HPIAS-1000高清晰度病理图文分析系统，在400倍高倍镜下观察每个标本，随机取5个视野，切片中细胞浆内有棕黄色颗粒为iNOS和VEGF阳性细胞，测量iNOS和VEGF阳性细胞的染色灰度，用相应背景灰度值与各测量点灰度值相减，最后的平均值作为最终灰度值，检测光密度值(OD)以及iNOS和VEGF阳性表达面积与统计面积之比的面密度(area densities，AD)，并采用OD均值及面密度均值。

1.3统计学方法:采用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用两独立样本t检验，变量间的相关分析，P＜0.05，表示差异有统计学意义。应用SPSS13.0软件进行统计学分析，结果以均数±标准差表示，灰度值组间比较采用成组设计资料t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1iNOS和VEGF的表达:在正常子宫内膜组织腺上皮的表达中呈弱阳性，高倍显微镜下观察可见细胞及组织着浅黄色呈散在分布；iNOS和VEGF在EMs中在位内膜组织中呈强阳性表达，主要分布在腺上皮细胞中，少量在间质，镜下细胞呈棕黄色或棕褐色成片或灶状分布。

表1　子宫内膜异位症与对照组子宫内膜中iNOS和eNOS的OD值比较

2.2EMs子宫内膜组织中iNOS和VEGF的表达:iNOS和VEGF表达的面密度:试验组EMs在位内膜组织的腺上皮及间质有片状及灶状强阳性iNOS和VEGF表达，而对照组正子宫内膜组织腺上皮及间质中iNOS和VEGF表达呈散在分布，两者面密度之间比较差异均有统计学意义，见表2。

表2　比较两组子宫内膜组织中iNOS和VEGF的面密度

2.3iNOS与VEGF表达的相关性:EMs在异位内膜组织中iNOS和VEGF呈强阳性表达，但对照组中，正常子宫内膜组织中iNOS和VEGF呈弱阳性表达，变量间的相关分析选用非参数统计方法，iNOS和VEGF表达的关联性分析，r = 0.895，P＜0.05，表明iNOS和VEGF呈明显正相关，在EMs中，iNOS可促进VEGF的表达，增加血管形成。

3 讨 论

子宫内膜异位症(EMs)的发病机制中“经血逆流”是主导学说，近年证实，90%女性均有经血逆流，但其中只有10%女性发生EMs[1]。说明经血逆流只是病因，而子宫内膜在腹腔内种植，血液供应的建立和支持是必不可少的，血管生成与EM的发生和发展密切相关，最重要的促血管生成因子是血管内皮生长因子(VEGF)[2]。VEGF具有促血管形成的功能[3]，VEGF是高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂原，在月经周期中，参与子宫内膜血管的形成。在病理情况下，VEGF与血管过度生成密切关系。VEGF的主要生理功能有[4，5]:①能促进细胞的有丝分裂，降解细胞外蛋白和基底膜，从而使血管内皮细胞迁移并增生。②增加血管的通透性，为血管芽延伸生长提供良好基质。③在细胞浆内，快速短暂地增加钙离子浓度，刺激磷脂酰肌醇的磷酸化，上调信号通路的表达。

VEGF受雌激素、细胞因子、缺氧因子等调节，在众多调节因素中，NO也参与了VEGF的调节。Kimura 等[6]发现NO具有类似低氧对VEGF的调节效应，NO与低氧诱导因子-1的结合位点结合，然后与VEGF启动子调控元件结合，增加VEGF的转录，从而促进局部血管的形成，并提高组织对缺氧的耐受性。

1979年首次发现NO，NO是内源性的血管舒张因子，半衰期很短，约5～10s。体内NO的生成量取决细胞内NO前体L-Arg的跨膜转运量与胞浆NOS的活性。它的产生需要一氧化氮合酶(NOS)的催化作用。在人体内，L -精氨酸(L -Arg)经一氧化氮合成酶(NOS)氧化生成NO，反应另一产物是L -瓜氨酸。NOS有三种同工酶，内皮型NOS(eNOS)、神经型NOS (nNOS)和诱导型NOS(iNOS)。

iNOS存在于巨噬细胞中，正常时不表达。但在EMs中，被各种细胞因子诱导，如TNF-α，IL-1等，是非Ca2+依赖的钙结合蛋白的酶，活性维持数小时至数天，催化生成大量NO，水平高达10-6～10-9mmoL/ L水平。

根据本实验结果，说明在EMs中，异位子宫内膜腺上皮iNOS的表达较对照组明显增高，表明患有EMs，其异位子宫内膜合成NO水平较正常子宫内膜明显增高，在EMs异位内膜中，iNOS和VEGF的表达呈明显正相关。

NO增加了血管壁的通透性，使单核巨噬细胞、粒细胞系从血管内外游至血管外，形成局部炎症，外游至血管外的单核巨噬细胞活化，经iNOS催化，不断产生NO，同时NO不断诱导单核巨噬细胞，两者相互作用，使局部形成炎症。在EMs中，NO引发的局部炎症、上调VEGF的表达，新生血管增加，促使异位子宫内膜在腹腔种植，生长，促进EMs的进展；同时，NO代谢的产物是NO-2/ NO-3，是NO发挥生理作用的代谢途径；另一种途径生成过氧亚硝酸根(ONOO-)，发挥NO的毒性作用。在EMs中，iNOS增高，诱使NO表达增高，增加血管壁的通透性，形成局部炎性反应。同时，NO可上调VEGF的表达，在EMs，iNOS和VEGF相互调节，促进EMs的发生发展。因此抑制iNOS对VEGF调控，可能为EMs的治疗开辟一个新的途径。

参考文献:

[1] Wu MY，Ho HN.The role of cytokines in endometriosis[J]. Am Reprod Immunol，2003，49(5):285～296.

[2] Barcz E，Milewski，Dziunycz P，et al.Peritoneal cytokines and adhesion formation in endometriosis: an inverse association with vascular endothelial growth factor concentration [J].Fertil Steril，2012，97(6):1380～1386.

[3] Li YZ，Li SL，Li X，et al.Expression of endogenous hypoxia markers in vulvar squamous cell carcinoma[J]. Asian Pac Cancer Prev，2012，13(8):3675～3680.

[4] Mahabeleshwar GH，Byzova TV.Angiogenesis in melanoma [J].Semin Oncol，2007，34(6):555～565.

[5] Walters EH，Reid D，Soltani A，et al.Angiogenesis :a potentially critical part of remoding in chronic airway disease[J] Pharmacol Ther，2008，118(1):128～137.

[6] Kimara H，Esumi H.Reciprocal regulation between nitric oxide and vascular endothelial growth factor in angiogenesis [J].Acta Biochim Pol，2003，50(1):49～59.

论著

Expression of iNOS and VEGF in Endometriosis

LI Yan，ZHU Jun
(The Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Xinjiang Wulumuqi 830000，China)

Abstract:Objective:To investigate the expression of iNOS and VEGF in endometriosis(EMs).Method:Immunochemical method was used to determine the expression of iNOS and VEGF in ectopic endometrium with EMs and the endometrium of controls.Result:The expression of iNOS and VEGF in endometriosis was significantly higher than that of normal endometrium.In ectopic endometrial，the expression of iNOS and VEGF was positively related (r = 0.895，P＜0.05).Conclusion:iNOS and VEGF plays an important role in the progression of endometriosis.

Key words:Endometriosis； iNOS； VEGF； Immunohistochemistry

文献标识码:A

doi:10.3969/ j.issn.1006-6233.2016.01.003

文章编号:1006-6233(2016)01-0007-03

*基金项目:新疆维吾尔自治区科技攻关和重点计划项目，(编号:200633146-4)