黄原胶对罗非鱼蛋白-大豆蛋白混合体系乳浊液稳定性的影响

兰冬梅，周春霞*，张梦霞，洪鹏志

1(广东省水产品加工与安全重点实验室，广东 湛江，524088)　2(广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，广东 湛江，524088)　3(广东海洋大学 食品科技学院，广东 湛江，524088)



黄原胶对罗非鱼蛋白-大豆蛋白混合体系乳浊液稳定性的影响

兰冬梅1,2,3，周春霞1,2,3*，张梦霞3，洪鹏志3

1(广东省水产品加工与安全重点实验室，广东 湛江，524088)2(广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，广东 湛江，524088)3(广东海洋大学 食品科技学院，广东 湛江，524088)

摘要以罗非鱼和豆粕为原料，采用碱溶-等电点沉淀法制备鱼分离蛋白(fish protein isolates，FPI)和大豆分离蛋白(soybean protein isolats，SPI)，固定蛋白浓度0.5%，在pH 4.0和7.0条件下，高压均质(一级压力30 MPa，二级压力4 MPa)，实验黄原胶(xanthan gum，XG)的添加对FPI、FPI-SPI(质量比2∶1)、FPI-SPI(质量比1∶1)和SPI乳浊体系粒径分布、微观显微结构和乳析指数的影响。结果表明：随着黄原胶的添加(0～0.09%)，乳浊体系平均粒径减小(P<0.05)；在pH 4.0条件下，乳浊液液滴聚集和絮凝现象明显减少，宏观乳析稳定性提高(P<0.05)，添加0.06%和0.09%黄原胶的FPI-SPI混合乳浊体系4 ℃放置10 d都没有明显的分层，而不同比例混合蛋白体系之间的差异不明显(P>0.05)；在pH 7.0条件下，添加0.06%的黄原胶时，FPI-SPI(质量比2∶1)和FPI-SPI(质量比1∶1)混合乳浊体系微观絮凝现象没有明显改善，宏观乳析稳定性明显提高(P<0.05)，4℃放置10 d没有明显的分层现象。总体分析，2种蛋白物理混合对乳浊液体系稳定性的改善程度有限，而适量的黄原胶能明显提高酸性条件下体系的乳浊液稳定性。

关键词鱼分离蛋白；大豆分离蛋白；鱼蛋白-大豆蛋白混合体系；黄原胶；乳浊液稳定性

罗非鱼(tilapia)是世界淡水渔业养殖和加工的主要鱼类之一，我国是世界最大的罗非鱼养殖国，2014年中国罗非鱼产量155万t[1]，占全球总产量的1/3。罗非鱼蛋白是一种优质蛋白资源，但在食品工业中的应用却受到极大限制，主要是因为其加工贮藏稳定性差，冷冻冷藏、热处理、酸/碱处理等都会使蛋白质发生变性，导致其溶解性及相关功能特性丧失[2-3]。天然大豆蛋白具有较好乳化、起泡、凝胶等功能特性，与鱼蛋白混合可以在一定程度上改善鱼蛋白的乳化活性[4]。“双蛋白”体系是目前食品行业研究的热点，目的在于结合动物蛋白的营养优势及植物蛋白的健康优势，在全民健康饮食中推广优质植物蛋白与优质动物蛋白相结合的健康型食品。近几年，我国在开发双蛋白产品方面主要集中在大豆蛋白肉制品凝胶特性的改善等[5-6]，而对混合体系乳化性的研究较少。蛋白质水包油型(O/W)乳浊液体系是食品中一类重要的胶体体系，同时也是一个热力学不稳定的多相体系。乳浊液会随着外界条件的变化(pH、离子强度、温度、油体积分数等)或贮藏时间的延长等出现乳析、沉淀、聚结等不稳定现象[7-9]。目前，国内外关于蛋白质乳浊液稳定性的改善手段有很多，其中应用最广的是添加多糖类物质(亲水性胶体)，可以大大改善乳状液连续相的流变特性，或形成空间网络结构，阻止由于热力学不兼容性引起的相分离现象或重力引起的分层[10-12]。黄原胶是一种高分子微生物阴离子多糖，以其优良的增稠特性或形成弱凝胶结构的特点而广泛应用于提高乳状液的稳定性[11-13]。为此，本研究选择乳化活性较差的中性和酸性(等电点附近)pH条件[4]，探讨黄原胶对罗非鱼蛋白-大豆蛋白混合体系乳浊液稳定性的影响。

1材料与方法

1.1材料与试剂

鲜活罗非鱼，购自湛江市麻章区湖光岩东当地市场，取其背部白肉、分装、-75 ℃储存备用，其粗蛋白含量(16.47±0.18)%；低温脱脂豆粕：山东万德福植物蛋白厂生产，其粗蛋白含量(51.3±0.23)%，豆粕粉碎后过100目筛备用；金龙鱼一级大豆油：食品级，益海粮油工业有限公司生产；黄原胶，Sigma试剂；其余试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

CR22G日立高速冷冻离心机，日本Hitachi公司；T-18高速分散均质机，德国IKA公司；AH100D高压均质机，加拿大ATS公司；Mastersizer 2000粒度分布仪，英国Malvern仪器公司；BX-51生物显微镜(Canon带Powershot G 10数码相机)，日本Olympus公司。

1.3实验方法

1.3.1罗非鱼分离蛋白(FPI)的制备

罗非鱼肉→加蒸馏水[鱼肉∶水=1∶9(g∶mL)]→均质2 min→调节pH值12.0→4℃搅拌提取10 min→冷冻离心(10 000 r/min，20 min，4℃)→上清液→调节pH 5.5→冷冻离心(10 000 r/min，20 min，4℃)→沉淀加少量冰水分散，调pH值7.0→冷冻干燥→罗非鱼分离蛋白(FPI)→其粗蛋白含量为(92.83±1.35)%

1.3.2大豆分离蛋白(SPI)的制备

低温脱脂豆粕粉→加蒸馏水分散[豆粕∶水=1∶10(g∶mL)]→调节pH值8.0→室温搅拌提取2 h→离心(8 000 r/min，25 min，4℃)→上清液→调节pH 4.5→冷冻离心(10 000 r/min，15 min，4℃)→沉淀加少量水分散，调pH值7.0→冷冻干燥→大豆分离蛋白(SPI)→其粗蛋白含量为(88.26±1.22)%

1.3.3蛋白-多糖乳浊液的制备

将一定量黄原胶分散于柠檬酸-咪唑缓冲液(10 mmol/L，pH 4.0或7.0)中，室温下低速搅拌3h，使其充分分散(加入0.01%的NaN3防止微生物繁殖)，将一定比例混合的罗非鱼蛋白-大豆蛋白分散于已制备的黄原胶溶液中(最终蛋白含量0.5%)，4℃水化12 h，然后向蛋白-多糖分散液加入质量分数5%的大豆油，用高速分散均质机分散，高压二次均质(均质前用相同pH值的缓冲液清洗均质机，均质压力为：一级30 MPa，二级4 MPa)，制备蛋白-多糖乳浊液，4℃条件下贮藏21 d。

1.3.4粒度分布的测定

采用激光粒度分布仪测定4℃条件下放置9 d的乳浊液液滴平均粒径(surface area mean diameter)d3,2。

1.3.5微观显微结构的观察

移取1滴4℃条件下贮藏7 d后的乳浊液到载玻片上，液滴分散均匀后盖上盖玻片，立即在显微镜下以400倍率下记录图像。

1.3.6乳析指数的测定

取新制备的乳浊液10 mL(HT)于乳析管中，4℃静置存放，定期观察，记录乳浊液分层后试管底部清液层的高度(HS)，乳液的稳定性用乳析指数(creaming index，CI)表征：

1.4统计分析

数据统计分析采用JMP 7.0程序进行方差分析，差异显著性(P<0.05)分析使用多重比较，作图采用origin 7.5软件作图。试验所得数据结果表示为(平均值±标准差)。

2结果与分析

2.1黄原胶对罗非鱼蛋白-大豆蛋白混合体系乳浊液粒径分布的影响

图1　黄原胶的添加对罗非鱼蛋白-大豆蛋白混合体系乳浊液粒度分布的影响(pH 4.0，4℃，9 d)Fig.1　Influence of xanthan gum on particle size distribution of mixture system emulsions for tilapia protein and soybean protein (pH 4.0，4℃, 9 days)

在微观层面上，乳浊体系粒径大小和分布状态能够反映体系的稳定性。根据体系粒径分布的变化，可以推测体系稳定性趋势。在pH 4.0和7.0条件下，高压均质制备罗非鱼蛋白-大豆蛋白混合体系乳浊液，4℃放置9 d，探讨黄原胶对混合蛋白乳浊液粒度分布和平均粒径的影响，结果如图1所示。总体分析，在试验范围内，黄原胶对乳浊液平均粒径的影响明显，且随其添加量的增加呈现减小并逐渐趋于平稳；在pH 4.0条件下，随着黄原胶的添加(0.06%)，试验各乳浊体系的平均粒径迅速减小(P<0.05)，粒径分布范围变窄(结果未显示)，且SPI乳浊液的变化最为明显；在pH 7.0条件下，与对照样相比，添加0.03%的黄原胶，各试验蛋白体系的d3,2值迅速减小(P<0.05)，之后随着黄原胶添加量的增大，液滴粒径变化不明显(P>0.05)，4种蛋白体系比较而言，SPI体系的平均粒径最小，添加0.03%的黄原胶其d3,2值约为1.08 μm;比较而言，pH 7.0时，鱼蛋白和大豆蛋白混合体系乳浊液平均粒径均比在pH 4.0时大，加入黄原胶(0.06%)，混合体系的粒径减小(P<0.05)。分析黄原胶改善体系乳浊液稳定性的关系很可能与蛋白质和多糖分子间复杂的相互作用有关：(1)蛋白质与黄原胶的热力学不相容性，一定浓度的多糖可以促进蛋白质在油-水界面上的吸附，降低界面张力，提高乳液的稳定性[14]；(2)黄原胶是一种阴离子多糖[13]，pH 4.0时，鱼蛋白分子表面带正电荷，两者发生静电吸附，体系的稳定性增加；而对大豆蛋白而言，在蛋白质等电点pH值附近，蛋白质分子表面净电荷几乎为零，黄原胶的负电基团增加蛋白质分子与油-水界面的接触[12]，提高了蛋白质的溶解度和乳化性；(3)pH 7.0时，蛋白质表面带净负电荷，但蛋白质某些区域或分子片段上仍存在部分正电荷，带正电荷的区域与阴离子多糖相互作用形成可溶络合物，提高蛋白质的乳化性[15]。此外，黄原胶还可以通过其增稠作用提高乳液黏度，阻碍乳化液滴的运动，提高体系的稳定性[10]。

2.2黄原胶对罗非鱼蛋白-大豆蛋白混合体系乳浊液微观结构的影响

微观结构能够反映乳浊体系的絮凝稳定性。罗非鱼蛋白-大豆蛋白高压均质乳浊液，4℃放置7 d，探讨黄原胶对混合体系乳浊液微观显微结构的影响，结果如图2和图3所示。

由图2、图3可知，(1)在试验范围内，黄原胶对乳浊体系微观结构的影响趋势不完全一致；(2)在pH 4.0条件下，未添加黄原胶的蛋白乳浊体系放置7 d后，出现了明显的颗粒聚集现象，液滴颗粒较大，由此表明蛋白质溶解性和乳化性较差，体系中存在大量未被吸附的蛋白质，乳粒周围渗透压降低，从而促使液滴之间相互吸引发生聚集[16]；添加黄原胶(0.03%)后可以增加蛋白吸附到油-水界面的机会，增加乳浊液的厚度，从而保持乳浊液的稳定性，显微镜下观察到乳液颗粒明显减小，局部出现轻微的聚集和絮凝；当黄原胶添加量达到0.09%时，没有明显的聚集现象，乳液分布均匀；比较而言，FPI-SPI(质量比2∶1)混合体系受到黄原胶的影响特别显著，液滴分散非常均匀；(3)在中性条件下，未添加黄原胶的混合体系乳液4℃下存放7 d后也发生了明显的聚集和絮凝现象(大豆蛋白除外)，且随着黄原胶的添加微观絮凝现象越来越明显，此现象很可能与乳浊体系中阴离子增多诱发的排斥絮凝有关[9, 17]。当乳液被稀释时，絮凝会被破坏，这也是乳液中存在大量絮凝体而粒径较小的原因[18]，因此，随着黄原胶的添加，体系的平均粒径减小(见图1)。

(a)、(b)、(c)、(d)分别表示FPI、FPI∶SPI质量比=2∶1、FPI∶SPI质量比=1∶1和SPI图2　黄原胶对罗非鱼蛋白-大豆蛋白混合体系乳浊液微观结构的影响(pH 4.0，4℃，×400，7 d)Fig.2　Influence of xanthan gum on emulsion microstructures of mixture system for tilapia protein and soybean protein (pH 4.0, 4℃, ×400, 7 d)

(a)、(b)、(c)、(d)分别表示FPI、FPI∶SPI质量比=2∶1、FPI∶SPI质量比=1∶1和SPI图3　黄原胶对罗非鱼蛋白-大豆蛋白混合体系乳浊液微观结构的影响(pH 7.0，4℃，×400，7 d)Fig.3　Influence of xanthan gum on emulsion microstructures of mixture system for tilapia protein and soybean protein (pH 7.0, 4℃, ×400, 7 d)

2.3黄原胶对罗非鱼蛋白-大豆蛋白混合体系乳浊体系乳析指数的影响

乳析现象是指乳浊液在放置一段时间后，体系由于重力场的作用，导致油水分离，油滴聚集上浮。而乳析指数能够说明发生乳析现象的程度。在pH 4.0和7.0条件下，探讨黄原胶对混合蛋白乳浊体系乳析指数的影响，结果见图4和图5。(1)pH 4.0，未添加黄原胶的试验蛋白乳浊体系的乳析指数均大于80%，放置1 d即出现明显的沉淀和油滴上浮，而黄原胶的添加使体系乳析现象改善；在试验范围内，当黄原胶添加量增加到0.06%时，各试验蛋白乳浊体系放置9 d没有明显的分层现象，表明一定浓度的黄原胶能增加乳浊液连续相的黏度，抑制相分离及重力引起的分层[11-12]；提高体系的宏观稳定性，且鱼蛋白体系的乳析稳定性最好，4℃放置21 d没有出现明显的沉淀和上浮现象；(2)大豆蛋白以及混合体系在10 d后出现油析，可能原因是此pH值接近大豆蛋白的等电点，蛋白溶解性和乳化性较差，经高压均质使蛋白吸附于油滴表面，但随时间的延长蛋白发生了解吸，由于物质密度较差，油滴上浮，蛋白沉淀；(3)pH 7.0时，在试验范围内，黄原胶的添加能加速大豆蛋白乳浊液失稳，再次表明一定浓度的黄原胶可诱发乳状液液滴的排斥絮凝，反而加快体系相分离[9, 17]。

图4　黄原胶对罗非鱼蛋白-大豆蛋白混合体系乳浊液乳析指数的影响(pH 4.0)Fig.4　Influence of xanthan gum on creaming index of mixture system for tilapia protein and soybean protein at pH 4.0

图5　黄原胶对罗非鱼蛋白-大豆蛋白混合体系乳浊液乳析指数的影响(pH 7.0)Fig.5　Influence of xanthan gum on creaming index of mixture system for tilapia protein and soybean protein at pH 7.0

3结论

综合分析黄原胶对FPI、SPI和FPI-SPI(质量比2∶1)和(1∶1)混合体系乳浊液粒度分布、微观显微结构和乳析指数的影响可知，黄原胶添加量为0.06%～0.09%时，乳浊体系平均粒径较小；在pH 4.0时，随黄原胶(0～0.09%)的添加，试验蛋白体系乳浊液的平均粒径减小(P<0.05)，且SPI体系最明显；液滴聚集和絮凝现象明显减弱，乳析稳定性提高(油析除外)(P<0.05)；添加0.06%和0.09%黄原胶的FPI-SPI混合乳浊体系4℃放置10 d都没有明显的分层，液滴分布均匀；在pH 7.0时，随着黄原胶的添加，体系粒径减小(P<0.05)，且罗非鱼蛋白体系粒径变化最明显；试验蛋白体系乳浊液絮凝稳定性没有得到改善，乳析稳定性提高(大豆蛋白体系除外)。综合分析，pH 4.0和7.0条件下，两种蛋白物理混合对乳浊液体系稳定性的改善程度有限，而适量的黄原胶能明显提高酸性条件下混合体系乳浊液的微观结构性质和宏观稳定性，为探讨“双蛋白”体系的形成和稳定提供了理论依据。

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Effect of xanthan gum on emulsion stability on tilapia and soybean protein mixture

LAN Dong-mei1,2,3, ZHOU Chun-xia1,2,3*, ZHANG Meng-xia3, HONG Peng-zhi3

1(Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety, Zhanjiang 5240888,China)2(Key Laboratory of Advance Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution, Zhanjiang 5240888,China)3(College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 5240888,China)

ABSTRACTFish protein isolates (FPI) and soy protein isolates (SPI) were prepared by alkaline solution and isoelectic precipitation. At fixed protein concentration of 0.5%, pH 4.0 and 7.0, the protein emulsion was prepared by high-pressure double-stage homogenization (30MPa and 4MPa). Xanthan gum amount on the effect for FPI, SPI, FPI-SPI (2∶1) and FPI-SPI (1∶1) mixed system as well as the particle size distribution, microstructure and flocculation stability of emulsion was studied. Results showed that the mean particle size of protein emulsion system decreased (P<0.05) with increasing addition of xanthan gum (0～0.09%). At pH 4.0, droplet aggregation and flocculation of emulsion decreased, and stability increased (P<0.05). No obvious separation was observed for FPI-SPI (2∶1) and FPI-SPI (1∶1) mixture emulsions with0.06% and 0.09% xanthan gum after 10 days stored at 4℃, and as no significant difference between two different ratios of mixture system (P>0.05). At pH 7.0, 0.06% of xanthan gum had little improvement on FPI-SPI (2∶1) and FPI-SPI (1∶1) mixture emulsions, while the stability was increased significantly (P<0.05), and no obvious separation was found after 10 days at 4 ℃. Results indicated that two proteins FPI SPI mixture had limited improvement on the emulsion stability, while xanthan gum can improve significantly of the emulsion stability at acidic conditions.

Key wordsfish protein isolates; soybean protein isolates; fish protein - soybean protein mixture; xanthan gum; emulsion stability

收稿日期：2015-07-13，改回日期：2015-07-29

基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2013AA102201)；广东海洋大学创新强校工程项目(GDOU2013050204)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602020

第一作者：硕士研究生(周春霞副教授为通讯作者)。