温度对四川泡菜中菌系及其代谢产物分布的影响

熊涛, 肖阳生, 李军波, 彭飞, 黄涛

(南昌大学 生命科学与食品工程学院，食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌,330047)



温度对四川泡菜中菌系及其代谢产物分布的影响

熊涛*, 肖阳生, 李军波, 彭飞, 黄涛

(南昌大学 生命科学与食品工程学院，食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌,330047)

摘要以市售圆白菜为原料，按照传统四川泡菜制作工艺，并分别控制在18、28、37 ℃下恒温发酵，监测发酵过程中卤水的pH、微生物(乳酸菌、酵母菌、大肠杆菌)、糖(蔗糖、葡萄糖、果糖)、有机酸(乳酸和乙酸)、乙醇含量的变化。结果表明：温度对传统四川泡菜发酵过程中的菌系结构和代谢有显著影响。温度越高，乳酸菌繁殖代谢越快，卤水pH值下降也越快；低温发酵泡菜中酵母菌和大肠杆菌存活时间最长，发酵周期也最长；28 ℃恒温发酵时大肠杆菌消亡最快，发酵结束时果糖和乙醇含量最低；37 ℃恒温发酵能较好地抑制大肠杆菌，对果糖和葡萄糖利用率最高，乳酸产量最高，发酵周期最短；温度对泡菜发酵中蔗糖利用率无显著影响。

关键词温度；泡菜；乳酸菌；酵母菌；代谢

传统四川发酵泡菜是利用蔬菜表面附着的微生物进行自然发酵。一年四季时令分明，作为餐桌上最普遍的家庭美食之一，温度的变化会对泡菜的品质造成一定影响，增加了泡菜工业化的难度[1]。从已有的研究来看[2-4]，有关温度对泡菜中微生物消长的研究较多，而针对性的研究温度对泡菜发酵过程微生物的消长、底物消耗、代谢产物合成的关联性研究较少。本实验结合四川地区四季温度变化特点，制作了高、中、低温3种恒温发酵泡菜。利用不同的选择性培养基对3种泡菜发酵过程中乳酸菌、酵母菌以及大肠杆菌进行计数，并利用高效液相色谱技术(high performance liquid chromatography，HPLC)对发酵过程中有机酸及糖醇的变化进行分析，研究了3个不同温度对传统四川泡菜发酵过程中微生物的结构变化、代谢底物和产物含量变化的影响，旨在揭示温度对泡菜发酵特性的影响，期望对传统自然发酵泡菜的食用安全及工业化生产提供科学依据和理论指导。

1材料与方法

1.1材料、培养基与试剂

新鲜圆白菜、冰糖、碘盐、辣椒、姜、大蒜、花椒均为市售。酵母菌分离计数培养基：虎红培养基，北京奥博星公司。乳酸菌分离计数培养基：MRS培养基，参照GB 4789.35—2010《食品卫生微生物学检验——食品中乳酸菌检验》方法配制。大肠杆菌分离计数培养基：结晶紫中性红胆盐琼脂，北京奥博星公司。蔗糖、果糖、葡萄糖、乙酸、乙醇、乳酸(分析标准品)，美国Sigma公司；浓硫酸、无水乙醇、氢氧化钠、氯化铁、氯化钠(分析纯)，上海国药集团化学试剂公司。

1.2仪器与设备

pHS-25型pH计，上海精密科学仪器有限公司；YXQ-LS-50SⅡ/75SⅡ立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；Airtech生物安全柜，苏净集团安泰公司；Agilent 1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；Aminex-87H色谱柱，美国伯乐公司；DNP-9272型生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司；

1.3实验方法

1.3.1传统四川泡菜的制作工艺及配方

传统四川泡菜工艺：

圆白菜→清洗→沥干→切分→装坛→密封→发酵→成品

↑盐水(花椒等辅料)

传统四川泡菜配方：100mL水中，添加白菜50 g，冰糖4 g，碘盐4 g，辣椒4 g，大蒜3 g，生姜2 g，花椒1.5 g。

1.3.2取样

泡菜从入坛开始直至发酵第7天，期间每隔12 h于超净工作台内进行取样。

1.3.3pH值的测定

使用pHS-25型pH计测定发酵液中的pH。

1.3.4乳酸菌和酵母菌的分离计数

无菌条件下，取1 mL发酵液于装有9 mL无菌生理盐水的试管中，摇匀，制成1∶10稀释菌悬液，按每级10倍的梯度稀释。选择合适梯度，分别涂布于MRS培养基置于37 ℃培养48 h、结晶紫中性红胆盐琼脂置于37 ℃培养24 h、虎红培养基置于30 ℃培养3～5 d后计数，每个梯度做2个平行涂布。

1.3.5发酵液中有机酸和糖醇的分析

将发酵液经离心(10 000 r/min，10 min)后取上清液，过0.22 μm水系滤膜后用于高效液相色谱分析。色谱条件：流动相为6 mmol/L硫酸溶液，进样量20 μL，流速为0.5 mL/min，柱温45 ℃，紫外检测器检测波长为205 nm。示差折光检测器用于检测糖醇(蔗糖、葡萄糖、果糖、乙醇)含量，紫外检测器用于检测有机酸(乳酸、乙酸)含量。

2结果与分析

2.1泡菜发酵过程中微生物的变化

多种微生物共同作用是传统四川发酵泡菜形成的关键，乳酸菌和酵母菌对泡菜中风味物质的形成起主要作用[5]，同时，泡菜发酵的过程也会伴随着一些致病菌的生长繁殖，其中大肠杆菌是泡菜中典型的致病菌，影响泡菜的风味以及食用安全性[6]，故监测乳酸菌、酵母菌以及大肠杆菌的变化对研究发酵泡菜有重要意义。

图1　泡菜发酵过程中乳酸菌、酵母菌和大肠杆菌的变化Fig.1　The changes of lactic acid bacteria,yeast and Escherichia coli during the fermentation

如图1-A所示，3种不同温度下发酵的传统四川泡菜中，乳酸菌初始菌数均处于104CFU/mL，2.5天内增加至108CFU/mL，其菌数在发酵中后期无明显变化。但是在37、28、18 ℃发酵泡菜初期，乳酸菌的生长情况有较大差异，分别于0.5、1、2.5天增长至108CFU/mL。这可能由于温度越高(一定范围内)乳酸菌生长迟滞期越短，繁殖越快，造成乳酸菌在3种温度下发酵泡菜前期的明显差异。在泡菜发酵中后期，卤水中有机酸的不断积累以及泡菜体系中底物的持续消耗，使乳酸菌数在发酵后期呈现略微的下降但未有明显的变化。

泡菜发酵过程中酵母菌的变化如图1-B所示，泡菜发酵的前1天酵母菌迅速繁殖，此后，在不同的温度条件下泡菜卤水中酵母菌的变化表现出明显差异。37 ℃和28 ℃发酵泡菜时酵母菌先增至105CFU/mL，随后快速消亡，分别在第3天和第4天完全消亡；而18 ℃发酵的泡菜卤水中酵母菌在第1天至第4天菌数稳定在104CFU/mL，随后逐渐下降并于第6天完全消亡，可见温度越高，酵母菌消失的越快。这可能是温度越高，泡菜体系中乳酸菌生长繁殖越迅速，其主要代谢产物乳酸也随之增加，而酵母菌的耐酸性能比较差，乳酸的积累对酵母菌有较强的抑制作用；另有研究表明乳酸菌代谢产生的化合物如苯乳酸、环肽等也会抑制酵母菌的生长[7]。

大肠杆菌发酵过程中的变化规律(图1-C)与酵母菌相似，不同的是酵母菌在37 ℃时消亡最快，而大肠杆菌则是在28 ℃时消亡最快。值得注意的是低温环境发酵泡菜时大肠杆菌受到的抑制作用较弱，直至第7天泡菜体系中的大肠杆菌才完全消失。腐败菌如大肠杆菌会将蔬菜中的蛋白质水解并转化为亚硝酸盐，对人体健康不利[8]，故在冬天制作传统四川泡菜时需要延长泡菜的发酵周期。

2.2泡菜发酵过程中发酵液pH值的变化

pH是微生物代谢活动的一项指标，同时也是影响微生物生长的重要因素，是一项重要的发酵参数[9]。泡菜发酵初期，乳酸菌迅速繁殖代谢并产生大量乳酸，使泡菜卤水pH值显著下降。

图2表现的是在3种不同温度下泡菜发酵过程中卤水pH的变化。在发酵前期卤水pH均迅速下降，中后期下降速度减缓。然而，泡菜发酵的前2天，37℃发酵的泡菜卤水pH下降速度较另两者快；在泡菜发酵终止时，18℃下发酵的泡菜卤水pH(pH=3.6)较另两者(它们的最终pH均为3.2)高。

图2　泡菜发酵过程中pH值的变化Fig.2　The changes of pH during the fermentation

泡菜发酵前3天肠膜明串珠菌等异型发酵菌迅速繁殖并代谢产酸使卤水pH值急剧下降，然而18℃下卤水pH值下降较其他两个温度缓慢，一方面低温环境下泡菜发酵前期乳酸菌增殖较慢，乳酸菌数较其他两个温度低，产酸也较少；另一方面，可能在低温条件下乳酸发酵途径中酶(如醛缩酶、乳酸脱氢酶)的活性较低[10]，影响乳酸菌产酸，从而减缓了卤水pH值的下降。发酵中后期，乳酸菌的繁殖代谢因卤水中的乳酸和H+大量积累而受到抑制[11]，乳酸代谢途径因乳酸的积累产生反馈抑制作用[12]，使卤水pH逐步趋于稳定。然而18℃发酵泡菜中卤水pH值在第7天只下降至3.6(其他两个温度稳步下降直至3.2)，泡菜发酵周期大大延长。可见，在自然发酵泡菜中温度对卤水pH值影响显著，而卤水pH值的变化取决于微生物代谢产生有机酸的含量。

2.3泡菜发酵过程中主要底物含量的变化

乳酸菌的生长代谢需要碳源，泡菜发酵体系内主要碳源是蔗糖、果糖和葡萄糖，主要来源于制作时加入的冰糖，其次蔬菜中原有的糖类也会浸出至卤水中[13]。

图3　泡菜发酵过程中主要底物的变化Fig.3　The changes of substrate concentrations during the fermentation

图3表示的是泡菜发酵过程中主要底物的变化规律。由图3-A可知蔗糖在整个发酵过程中均有代谢利用。发酵前期乳酸菌的快速生长繁殖对碳源的需求极大；此外，一些细菌和真菌代谢也能利用蔗糖[14]，导致蔗糖被大量代谢，含量迅速下降。随着发酵的进行，发酵过程渐渐由异型乳酸(如肠膜明串珠菌)发酵主导转变为同型乳酸发酵(如植物乳杆菌)主导[15]，而植物乳杆菌较肠膜明串珠菌对蔗糖的利用能力更差[16]，但是3个温度下发酵泡菜中乳酸菌在中后期能保持较高的活菌数(108CFU/mL)，导致泡菜在发酵后期依然对蔗糖保有一定的利用率，使得不同温度下蔗糖的利用率无显著差异。从图3-B中可以看出发酵泡菜中葡萄糖在前期均快速上升，一方面，在泡菜发酵前期如肠膜明串珠菌可以产生葡萄糖蔗糖酶将蔗糖转换化为葡萄糖[17]，另一方面，圆白菜组织中的葡萄糖也能通过渗透作用渗出至卤水中。中后期葡萄糖含量均缓慢上升，其中18 ℃发酵泡菜的葡萄糖含量明显高于其他两个温度，可能是由于酵母菌在该环境中消亡更慢，已有研究表明泡菜中的一些细菌(如醋酸菌)和真菌(如酵母菌和霉菌)的繁殖也会代谢蔗糖产生葡萄糖和果糖[14]；另外作为产乳酸的前体物质[18]，葡萄糖在高温情况下利用率更高，导致低温条件下葡萄糖残留量远高于其他两个温度。果糖同样作为酵母菌代谢蔗糖的产物，其变化规律和葡萄糖大致类似，发酵过程中始终保持上升的趋势，在低温时残量最高。

2.4泡菜发酵过程中主要代谢产物含量的变化

乳酸是泡菜体系中最主要的有机酸，是乳酸菌代谢的重要产物[19]，乳酸主要来源于同型乳酸发酵代谢途径，以1个葡萄糖分子为底物，经糖酵解途径降解产生2分子丙酮酸，后者再作为氢接受体被还原成2分子乳酸，并产生2分子ATP[20]，乳酸含量直接影响泡菜的风味和泡菜体系中菌的分布和稳定性。

图4　泡菜发酵过程中代谢产物的变化Fig.4　The chang of metabolic products during the fermentation

图4-A表示了乳酸在不同温度下传统四川泡菜发酵过程中的变化趋势，其含量在发酵前1.5天均缓慢升高，第1.5～4.5天快速积累，之后又缓慢升高。尽管乳酸菌在泡菜发酵的前2天已增至108CFU/mL，与此同时蔗糖也被大量消耗，乳酸的积累量却并不大。一方面可能是主导泡菜前期发酵的异型乳酸菌如肠膜明串珠菌产酸能力较弱；另一方面泡菜体系中中存在如霉菌、酵母菌等微生物能代谢蔗糖但不产生乳酸。泡菜发酵中后期，卤水中乳酸和H+随着发酵的进行大量积累，导致乳酸含量快速上升。37℃时泡菜可能提前进入同型发酵阶段，主导泡菜发酵的同型乳酸菌如植物乳杆菌产酸能力较强[21]，在代谢利用等量的碳源比异型发酵能产生更多的乳酸，而18℃环境中乳酸菌生长代谢速率缓慢，如肠膜明串珠菌等异型发酵菌株产乳酸能力较弱，导致乳酸含量上升缓慢并一直低于其他两个温度。整体而言，乳酸的产量与温度(在一定范围内)呈正比关系。

乙酸是乳酸菌经过异型乳酸发酵途径的产物之一，适量的乙酸对泡菜风味物质具有促进作用[22]。泡菜发酵前期，微生物迅速生长代谢并产生乙酸，使其含量有一定的增加。发酵中后期，pH的下降使得不耐酸的异型发酵菌逐渐死亡，乙酸含量逐渐趋于稳定并呈略微的下降。可能是18℃发酵泡菜中异型乳酸菌存活时间更长导致卤水中乙酸的含量较其他两个温度高。

图4-C描述了乙醇含量的变化趋势。前期发酵环境较适合微生物生长，酵母菌和其他异型发酵菌株迅速繁殖并代谢蔗糖产生乙醇，使其含量迅速上升。到中后期异型发酵菌株相继消亡使得乙醇的含量逐渐趋于稳定。18℃ 环境中乙醇的含量远高于其他两个温度，可能是低温下酵母菌存活时间最长导致其乙醇含量最高，这验证了泡菜体系中的乙醇主要来源于酵母菌的代谢。

3结论与展望

通过对不同温度下的传统四川泡菜发酵研究表明，温度越高,乳酸菌、大肠杆菌和酵母菌在发酵前期繁殖越快，同时大肠杆菌和酵母菌的消亡时间也越短。泡菜卤水pH值下降速率与温度成正比，18 ℃下泡菜发酵至第7天时卤水pH值为3.6，尚未达到成熟。碳源方面，温度对蔗糖的利用无显著影响；葡萄糖和果糖在37℃下发酵时，它们的利用速率要显著快于另两个温度下的发酵。代谢产物方面，低温时乙醇和乙酸的含量较高，乳酸的产量与温度成正比；综上所述，37℃环境中乳酸菌的繁殖代谢最快，乳酸产量最高，能较好的抑制大肠杆菌，对葡萄糖和果糖的利用率最高，大大缩短了发酵周期。温度的改变对泡菜发酵过程中菌系的消长、微生物的代谢影响显著，不仅表现在泡菜发酵周期和各指标差异明显，更重要的是对泡菜食用安全造成一定影响。可进一步研究温度对亚硝酸含量以及泡菜风味的影响，进而为我国泡菜工业化生产提供理论依据。

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Effects of temperature on strains and metabolism of Sichuan pickled cabbage

XIONG Tao*,XIAO Yang-sheng, LI Jun-bo, PENG Fei, HUANG Tao

(State Key Laboratory of Food Science and Technology, College of Life Science and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

ABSTRACTThe traditional Sichuan pickled cabbage naturally fermented at different temperature (18, 28, 37℃) was studied, by comparing the pH values of the brine and the main microorganisms including lactic acid bacteria, yeast and Escherichia coli and monitoring the content changes of sugars (sucrose, glucose, fructose), organic acids (lactic acid and acetic acid), ethanol. Results showed that temperature had a significant influence on the changes of microorganisms and metabolism during the sichuan pickle cabbage fermentation. Lactic acid bacteria grew faster and pH value decrease more quickly at high temperature. Yeast and E.coli had the longest survival time and longest period of fermentation. At 28℃，it showed better inhibition on the growth of E.coli, while the reproduction of fructose and ethanol were the lowest. The utilization of glucose and fructose was outstanding and the yield of lactic acid was the highest at 37℃, fermentation cycle was also shortened. The temperature had no significant effect on the utilization of sucrose.

Key wordstemperature; pickled cabbage; microorganisms；metabolism

收稿日期：2015-07-15，改回日期：2015-09-08

基金项目：国家自然科学基金项目(31560449)；国家“十二五”首批863计划(2011AA100904)；“赣鄱英才555工程”领军人才培养计划项目(18000063)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602014

第一作者：博士生导师，教授(本文通讯作者，E-mail:xiongtao0907@163.com)。