3株太湖溶藻细菌的分离及溶藻特性的初步研究

刘征宇，宁喜斌，李文利，王志坚，山树斌，李晓晖

(上海海洋大学 食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海，201306)



3株太湖溶藻细菌的分离及溶藻特性的初步研究

刘征宇，宁喜斌，李文利，王志坚，山树斌，李晓晖*

(上海海洋大学 食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海，201306)

摘要选择藻华现象严重的太湖作为采样点，取6个不同位置的水样加入含有对数期藻液的三角瓶中，取藻液有黄化现象的对应水样作为分离溶藻细菌的材料，初筛得到21株细菌，其中3株细菌表现出较强的溶藻作用，编号分别为A09、A10、A21。经6 d溶藻实验，菌株A09、A10、A21对Microcstis aeruginosa 905藻细胞清除率分别达到93.11%、88.71%、97.20%，叶绿素a清除率分别为87.63%、83.48%、93.16%，溶藻能力A21> A09 > A10，均为高效的溶藻细菌。经生理生化鉴定及16S rDNA 分子鉴定，A09菌株为鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)、A10菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、A21号菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。3株溶藻细菌的溶藻机制均为胞外释放某种物质进行间接溶藻，且这种或几种物质具有极强的热稳定性，属于非蛋白类物质。

关键词溶藻细菌；铜绿微囊藻；鞘氨醇杆菌;解淀粉芽孢杆菌; 蜡状芽孢杆菌；太湖

随着全球水体富营养化的加剧，有害藻类水华和赤潮的爆发日趋频繁造成严重的环境和经济问题[1-2]。为了解决这一问题，人们采用了物理法(直接打捞、过滤、超声波等)、化学法(药剂杀灭法、絮凝剂沉法等)和生物法等[3]，但物理法控藻费用高，难以大面积使用；而化学法控藻容易产生二次污染，造成环境污染或生态平衡的破坏，甚至给人类带来更多危害。因此，人们把更多的目光投向了生物法控藻[4]。

溶藻细菌(Algicidalbacteria)是以直接或间接方式抑制藻类生长或杀死藻类，溶解藻细胞的细菌的统称，是水生态系统生物种群结构和功能的重要组成部分，对维持藻生物量平衡具有非常重要的作用[1]。溶藻细菌及其活性代谢产物的开发已经成为水体藻污染生物防治的新举措。溶藻细菌的研究在国外已有数十年历史。早在1924年, GEILER报道一种粘细菌Polyangiumparasitium寄生在刚毛藻Cladophora上，使藻死亡[5]。溶藻细菌在国内外文献中陆续有一些报道[6-12]，这些细菌多为革兰氏阴性菌，它们的作用对象比较广泛，既有蓝藻,也有硅藻和甲藻。本文的主要目的是采用原位取样法分离太湖水域中的溶藻细菌，在研究溶藻细菌的分离、鉴定及溶藻机制的基础上，为利用溶藻微生物治理水华提供理论基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试藻种

铜绿微囊藻905(Microcstisaeruginosa905)购于中国科学院野生生物种质库——淡水藻种库，培养条件为28 ℃、光照强度2 000 lx光暗比14 h∶10 h[11]，预培养1周。

1.1.2主要试剂

营养肉汤和营养琼脂用于溶藻细菌的分离与纯化；铜绿微囊藻的培养基BG11培养基用于铜绿微囊藻的培养。

1.1.3主要仪器

智能型光照培养箱SPX-250PG，上海天恒医疗机械有限公司，；紫外可见分光光度计SQ-UV2300，北京宇艾奇电子科技有限公司；光学显微镜CX21，OLYMPUS；琼脂糖水平电泳仪DYCP-32B，北京六一仪器厂；凝胶成像系统GelDoc XR+，Bio-Rad美国伯乐公司；血球计数板，求精仪器；多管架自动平衡离心机TDZ5-WS，湘潭湘仪仪器有限公司；临界点干燥仪，英国Quorumm/Emitech)；超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2实验方法

1.2.1水样采集

本实验的水样取样方法为原位取样法[12]，即分离细菌的水样采至太湖发生水华现象水域，用灭菌的锥形瓶取水表面5 cm以下水样，低温避光保藏，共设置6个不同位置的取样点。

1.2.2溶藻水样筛选和溶藻细菌的分离

初筛：取10 mL水样直接感染90 mL对数生长期的M.aeruginosa905，按1.1.1的方法静置培养7 d左右，每天观察并记录藻的生长情况。若有水样出现黄化现象，取该黄化水样按1∶9的比例加入新鲜对数生长期的藻液中观察溶藻现象，对仍具有溶藻现象的水样，重复上述操作3次。如仍有溶藻能力，将样品梯度稀释，用营养琼脂平板分离黄化藻液的细菌[13]。

复筛：纯化后的细菌接入到营养肉汤中37 ℃ 培养24 h[14]。取1 mL菌液加入9 mL生长对数期的M.aeruginosa905，取无菌营养肉汤按上述方法加入作为对照组，1.1.1方法混合培养7 d观察是否有黄化现象。若有，该细菌为溶藻细菌。

1.2.3溶藻细菌生长曲线的测定

取5.0 mL培养18 h的溶藻菌培养液加入100 mL液体培养基中，37 ℃振荡培养，每2 h取样，用紫外可见型分光光度计在600 nm处测量吸光度[15]。

1.2.4菌种生理生化及分子鉴定

形态观察及生理生化鉴定根据《常见细菌系统鉴定手册》[16]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[17]。

16S rDNA 序列测定及同源性分析： 1) 基因组 DNA提取用蛋白酶K法[18]。2)PCR 扩增及序列测定：用通用引物[19](正向27f： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向1492R： 5′-GGTTACCTTG￣TTACG￣ACTT-3′)进行PCR扩增， PCR产物经检测纯化后，送上海生工测序。3 )数据处理：测序结果用Chromas软件拼接、将序列提交到Genebank中进行Blast比对并用MEGA5构建系统发育树。

1.2.5铜绿微囊藻藻细胞数量变化的测定

取1 mL有黄化现象的藻菌培养液，用血球计数板在显微镜下用5点法记录藻细胞数量，按公式(1)[20-22]计算细菌的溶藻能力(A) ：

A/%=(1-Dt/Dc)×100

(1)

其中：Dt(cell/mL)和Dc(cell/mL)分别指培养到计数当天实验组和对照组的藻细胞浓度。

1.2.6铜绿微囊藻叶绿素a浓度的测定[23-24]

取4 mL有黄化现象的藻菌培养液，离心取沉淀，加入等体积的90 %丙酮充分混匀，离心管用铝箔纸包裹，在冰浴条件下超声处理(200 W,5 s超声，5 s间隙，20个循环)，然后将所有提取液放置在黑暗低温的环境中萃取12～18 h(不得超过24 h)。将提取液放入冷冻离心机中离心，转速12 000 r/min下离心20 min，将上清液移入试管，分别在 630、647、664和 750 nm下测定吸光度。叶绿素a含量计算:

C(mg/L)=11.85(A664-A750)-1.54(A647-A750)-0.08(A630-A750)

(2)

其中：A664、A647、A630、A750分别表示提取液在波长为664、647、630和 750 nm时的吸光度。

根据公式(3)计算细菌的溶藻能力(A) :

A/%=(1-Dt/Dc) ×100

(3)

其中：Dt和Dc分别指培养到计数当天实验组和对照组的叶绿素a浓度。

传统教学模式下，采用固定的课本，在很大程度上限制了学生的思维。因为那些教材内容陈旧，即使更新教材，但大多数的知识还是沿用原有内容，有的甚至原文照搬，新的知识点几乎没有补充。而且一本书从编写、修正到印刷出版，再到学生手中，需要经历很长一段时间，这其中的种种原因，导致学生所接触到的知识与他们所需要的知识相脱节，对学生的学习形成很大制约，培养的人才与社会需求不相匹配。再者，传统教学模式学生只会学习本专业知识，很少甚至不涉猎其他专业知识。而随着专业之间的相互渗透与交叉，社会需要精通多个领域的复合型人才。基于此，高校需要改变传统教学模式，培养适应时代需求的战略性人才。

1.2.7溶藻实验

1.2.7.1高效溶藻细菌对铜绿微囊藻生长的影响

取复筛得到的高效溶藻细菌经过2次营养琼脂复壮后在最适温度下接种于新鲜营养肉汤培养基中培养，稀释到同一浓度(109CFU/mL),将几种菌液分别以6%的接种量与100 mL对数生长期的M.aeruginosa905藻液混合，在150 mL的锥形瓶中培养。取相应量的无菌的营养肉汤与生长对数期的M.aeruginosa905藻液混合作为对照组，按照1.1.1的方法培养，每天观察并记录藻液的颜色变化和生长情况。

1.2.7.2高效溶藻细菌溶藻方式的探究

为探讨溶藻细菌的溶藻方式，将复筛得到的高效溶藻细菌在最适温度下培养24 h，将培养液进行如下处理：

(1)菌体破碎：细菌培养液经8 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清液，用生理盐水洗涤菌体2次，BG11重悬，超声破碎菌体。

(2)菌液：不做任何处理。

(3)离心过滤菌液上清：细菌培养液经8 000 r/min，4 ℃离心10 min，用0.22μm玻璃纤维滤膜过滤上清液2次。

(4)高热处理菌液上清液：细菌培养液经8 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清液用121℃，高温灭菌20 min。

2实验结果与分析

2.1溶藻水样筛选及溶藻细菌的分离

初筛：对太湖6个水样进行溶藻实验，通过反复筛选，水样3、6具有溶藻效应，实验5 d的结果如图1所示。水样3和6对M.aeruginosa905的溶藻效果非常好，藻细胞浓度分别由1.11×106cell/mL、1.15×106cell/mL下降至1×105cell/mL、8.9×104cell/mL，溶藻效率可达到91.99 %和92.26 %，藻液颜色由绿色变淡色。这说明水样3和6中可能含有高效的抑藻微生物，因此将此两组黄化水样用于溶藻细菌的分离。

图1　溶解M. aeruginosa 905水样初选结果Fig.1　Algicidal selection results of water samples

复筛：从黄化水样中初筛共分离出21株细菌，分离所得菌株对M.aeruginosa905均有抑制作用，抑藻效率在10.9%到81.14%不等。进行复筛后，其中有3株细菌溶藻效果较为明显，分别为A09、A10和A21。这3株溶藻细菌在8d里对藻细胞浓度的影响如图2所示，溶藻效率分别为67.03% 、65.98%、81.14%，其他菌株溶藻效率均在50%以下。

图2　A09、A10和A21对M. aeruginosa 905生长的影响Fig.2　The effect ofA09，A10 and A21 on the M. aeruginosa 905

2.2溶藻细菌的生长曲线

3株溶藻细菌的生长曲线如图3所示。可以看出，A09在2 h内处于迟缓期，2 h后即进入对数生长期，16 h进入稳定期。A10迟缓期也为2 h，随后进入对数生长期，16 h进入稳定期。A21迟缓期不明显，快速进入对数生长期，6 h进入稳定期。由于采用比浊法测定细菌浓度，因此并未观察到明显的衰亡期。3株溶藻细菌总体生长速度A21>A10 >A09。最适生长温度A09、A10为30 ℃，A21为37 ℃。

图3　A09、A10和A21的生长曲线Fig.3　The growth curve of A09，A10 and A21

2.3溶藻细菌的鉴定

2.3.1形态观察及生理生化实验

A09为革兰氏阴性菌，菌落形态呈不透明淡黄色，单菌落为圆形，边缘整齐，表面凸起且光滑，质地粘稠。A10为革兰氏阳性菌，菌落形态呈不透明黄色，圆形，边缘整齐，表面凸起且光滑，质地粘稠。A21为革兰氏阳性菌，菌落形态呈不透明乳白色，圆形，边缘不整齐，表面凸起且粗糙，质地湿润。菌落形态如图4所示，3株溶藻细菌菌落观察及生理生化实验结果如表1所示。

图4　A09、A10和A21的菌落形态Fig.4　Strain form of A09，A10 and A21

特征A09A10A21菌落形态圆形圆形圆形菌落颜色浅黄黄色白色表面状态光滑光滑粗糙菌落光泽有光泽有光泽有光泽干湿程度湿润极湿润湿润细菌形状杆状杆状杆状革兰氏染色-++芽孢染色-++荚膜染色---氧化酶实验+--接触酶实验+++葡萄糖产酸+++麦芽糖产酸+++乳糖产酸+++木糖产酸+++运动性+++30℃生长+++++37℃生长++++

2.3.2溶藻细菌的分子鉴定及系统发育树

利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测3株溶藻细菌的16S rDNA 扩增产物， 均得到特异性条带， 片段大小为1 500 bp左右，用BLAST程序对A09、A10和A21的16S rDNA 序列与Genbank中已经登录的16S rDNA序列进行核苷酸序列同源性比较，结果表明A09为鞘氨醇杆菌(sphingobactiumsp)，A10为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、A21为蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)，3株细菌的基因序列相似性均达到99%。A09、A10和A21的电泳图谱、系统发育树如图5、图6所示。

图5　A09、A10和A21的16S rDNA电泳图谱Fig.5　The electrophoretogram of DNA and PCR products of A09，A10 and A21

图6　A09、A10和A21的系统发育树Fig.6　Phylogenetic tree of A09，A10 and A21

2.43株溶藻细菌的溶藻实验

2.4.13株溶藻细菌对铜绿微囊藻生长的影响

3株溶藻细菌对微囊藻细胞数及叶绿素a的抑制效果如图7、图8所示，由图可见溶藻细菌A09、A10、A21均有很明显的溶藻效果。实验第6天对照组藻细胞数为1.68×107cell/mL，经A09、A10、A21处理后的藻液中藻细胞浓度分别为1.16×106cell/mL、1.90×106cell/mL和4.71×105cell/mL，藻细胞清除率分别达到93.11%、88.71%和97.20%，溶藻效果A21> A09> A10，实验第8天经A21处理的藻液已观察不到成形的藻细胞。叶绿素a的清除效果与实验时间成正比，实验第6d A09、A10、A21叶绿素a清除率分别为87.63%、83.48%和93.16%，实验第8天 3株溶藻细菌的叶绿素a清除率均在90%以上。

图7　A09、A10和A21对铜绿微囊藻浓度的影响Fig.7　The effects of A09，A10 and A21 on the M. aeruginosa 905 cell concentration

图8　A09、A10和A21对铜绿微囊叶绿素a的清除率Fig.8　The influences of A09，A10 and A21 on the removing chlorophyll rate

2.4.23株溶藻细菌溶藻方式的探讨

实验表明,溶藻细菌A09、A10、A21的菌液、过滤上清液以及高温处理后的上清液均有明显溶藻效果，相比之下其菌体破碎组的溶藻效果并不明显。实验第6天，与对照组的1.96 mg/L相比，A09、A10、A21过滤上清液处理组叶绿素a含量分别为0.18mg/L、0.17mg/L和0.13mg/L，叶绿素a的清除率分别为 90.81%、91.25%和 93.07%，清除效果显著。且A09、A10、A21的过滤上清液处理组与原菌液的清除率几乎相同, 说明它们的溶藻方式不是直接溶藻, 而是通过释放某种胞外物质进行间接溶藻。同时A09、A10、A21经过高温处理后的高热上清组也有明显的溶藻效果, 叶绿素a的清除率分别为 89.60%、91.30%和 94.20%，与滤上清组效果几乎相同，说明它们胞外释放的溶藻物质具有很强的热稳定性，属于非蛋白质类物质。

图9　A09、A10和A21溶藻方式的探讨Fig.9　The results of mechanism of A09，A10 and A21

3结果与讨论

本研究从太湖水样中分离得到21株具有溶藻特性的菌株，通过其水华优势藻种铜绿微囊藻905在实验室条件下测定溶藻能力确定菌株A09、A10、A21为高效的溶藻细菌。菌株A09、A10、A21通过菌落形态观察、部分生理生化实验及16S rDNA分子实验进行鉴别，3株溶藻细菌分别为鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriumsp)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)。目前已报道的溶藻细菌以革兰氏阴性居多，本实验筛选结果为一株革兰氏阴性菌，两株革兰氏阳性菌，阳性菌数量多于阴性菌，且唯一的革兰氏阴性菌A09为溶藻方面报道较少的鞘氨醇杆菌，并显示出了良好的溶藻效果。A10为解淀粉芽孢杆菌，与许波[25]、于靓[26]分离的溶藻细菌属于同一菌种。A21为蜡状芽孢杆菌，与刘晶[27]、史顺玉[28]分离的溶藻细菌属于同一菌种。溶藻实验6d后，菌株A09、A10、A21的藻细胞去除率分别为93.11%、88.71%、97.20%，叶绿素a清除率分别为87.63%、83.48%、93.16%，均为高效的溶藻细菌。

细菌溶藻方式一般有2种：直接溶藻与间接溶藻。直接溶藻即细菌直接进攻宿主，与藻细胞直接接触，甚至侵入藻细胞内。间接溶藻指溶藻细菌同藻类竞争营养物质或分泌特异性或非特异性的胞外溶藻物质杀死藻类，如氨基酸、多肽、抗生素、蛋白质等等，其中分泌胞外溶藻物质是溶藻的主要方式。本实验通过溶藻方式探讨发现这3株细菌均通过胞外释放某种物质进行间接溶藻，且该种或几种物质具有极强的热稳定性，显然不属于蛋白类物质。间接溶藻的机理一般为溶藻物质通过生理过程如抑制细胞壁生成、阻断呼吸链、破坏藻细胞膜的完整性及减弱光能转化效率等达到抑藻效果。那么在A09、A10和A21的滤过上清液溶藻过程中，藻液体系中的丙二醛含量(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、藻细胞结构损伤程度、光能转化效率及电子传递速率如何变化，将是下一阶段研究的重点。

利用细菌来防治水华和赤潮等环境问题已成为主流，菌株A09、A10和A21对蓝藻水华的优势藻种(铜绿微囊藻)有显著的抑制效果，为蓝藻水华的防治提供了新的选择。通过对其溶藻特性的逐步深入研究，揭示溶藻机理及特性，有望加深对菌藻关系以及其相互作用的理解。

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Isolation and primary study of three algicidal bacteria strains of Tai lake

LIU Zheng-yu, NING Xi-bin,LI Wen-li, WANG Zhi-jian,SHAN Shu-bin,LI Xiao-hui*

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing and Preservation,Shanghai 201306, China)

ABSTRACTWater samples were collected at six sampling points of Tai lake, a eutrophic and algal bloom lake. The culture was mixed with test anabaena in log phase. Strains were isolated from the yellowing algae culture via repeat tests. Among 21 isolates, three bacterial strains A09, A10 and A21 presented relatively strong ability of Algal-lysing in Microcstis aeruginosa 905. The clearance rates of algal cells in six days were 93.11 %, 88.71 % and 97.20 %, and the rates of removing chlorophylla were 87.63 %, 83.48 % and 93.16 % respectively. The algal-lysing ability from high to low was as follows: A21> A09 > A10. Physiology biochemistry experiments and 16S rDNA molecular detection were carried out for strain identification. A09，A10 and A21 were assigned to Sphingobacterium sp, Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus cereus, respectively. A09, A10 and A21 were proved indirectly to dissolve algae. Results showed that the three strains could secrete one or several kinds of small nonprotein molecules with resistance to high temperature and high pressure to dissolve algae.

Key wordsAlgicidal bacteria; Microcstis aeruginosa; Sphingobacterium sp.;Bacillus amyloliquefaciens; Bacillus cereus; Tai lake

收稿日期：2015-09-15，改回日期：2015-11-13

基金项目：上海市科委工程中心建设项目(11DZ2280300)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602011

第一作者：硕士研究生(李晓晖副教授为通讯作者，E-mail:xhli@shou.edu.cn)。