髓样细胞触发受体-1在寻常型银屑病中的表达及意义

涂　晨，王　爽，张　扬，任建文，王晓鹏，肖生祥

(西安交通大学第二附属医院皮肤科，陕西西安　710004)



◇临床研究◇

髓样细胞触发受体-1在寻常型银屑病中的表达及意义

涂晨，王爽，张扬，任建文，王晓鹏，肖生祥

(西安交通大学第二附属医院皮肤科，陕西西安710004)

摘要：目的通过对比髓样细胞触发受体-1(Trem-1)在寻常型银屑病患者与正常人皮肤组织及血液中的表达差异，探索寻常型银屑病发病的可能机制。方法采用免疫组化及实时荧光定量PCR的方法检测Trem-1在不同组织中的表达情况，应用SPSS21.0统计软件进行统计学分析。结果Trem-1在寻常型银屑病患者皮损中表达增加，主要表达于表皮全层，正常皮肤组织中主要表达于基底细胞层，其表达差异具有统计学意义(P<0.05)。Trem-1 mRNA在寻常型银屑病皮损、血液中表达升高，与正常组相比差异具有统计学意义(P<0.05)；且Trem-1mRNA表达与银屑病皮损面积和严重程度指数(PASI)呈正相关(P<0.05)。结论Trem-1的异常表达可能参与了寻常型银屑病发病，Trem-1可能成为治疗寻常型银屑病的潜在靶点。

关键词：髓样细胞触发受体-1；寻常型银屑病；免疫组化；实时荧光定量PCR

髓样细胞触发受体-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1, Trem-1)是新发现的模式识别受体中重要的调控炎症反应因子，主要表达于中性粒细胞及单核细胞等细胞表面[1]。研究显示，Trem-1在感染性疾病中表达显著增高，通过激活相关信号通路，引起炎性因子白细胞介素-8(IL-8)、单核细胞渠化蛋白(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等的表达升高，放大炎症反应[2]。

寻常型银屑病是一种常见的慢性皮肤炎性疾病，发病机制复杂，免疫、遗传及炎症等多种因素均参与其中。Trem-1作为一种炎症触发受体，在炎症性疾病的发病中具有重要作用。但目前Trem-1与寻常型银屑病之间的相关性研究尚未见报道。本研究初步检测及对比Trem-1在寻常型银屑病及正常人皮肤组织和血液中的表达差异，探讨Trem-1在寻常型银屑病发病中的作用。

1材料与方法

1.1临床资料经临床与皮肤组织病理检查确诊的寻常型银屑病患者25例(男14例，女11例，年龄22～65岁，病程从2个月到15年不等)。所有寻常型银屑病患者近2个月内未系统服用维A酸、类固醇激素、免疫抑制剂等药物。2周内未使用任何外用药物。排除自身免疫性疾病及其他严重疾病，排除孕妇及哺乳期患者，排除不合作或临床资料不完整患者。寻常型银屑病严重程度(PASI评分)：鳞屑程度分(D)、浸润程度分(I)和红斑程度分(E)。PASI分数=头部面积分×头部严重程度分(D、I、E之和)×0.1+上肢面积分×上肢严重程度分(D、I、E之和)×0.2+躯干面积分×躯干严重程度分(D、I、E之和)×0.3+下肢面积分×下肢严重程度分(D、I、E之和)×0.4。评分越高病情越重。20例正常皮肤组织来源于外科手术切下的皮肤组织对照组者(男12例，女8例，年龄21～54岁)，两组间年龄及性别差异无统计学意义。

1.2主要试剂Trem-1山羊多抗购自Santa Cruz Biotechnology；山羊SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；RNAisoplus、RNA逆转录试剂盒、Real-time PCR试剂盒均购自大连宝生物有限公司。

1.3样本处理25例寻常型银屑病患者皮肤组织及20例正常皮肤组织的一部分进行常规石蜡包埋、切片；另一部分组织经生理盐水冲洗，研磨后加入RNAisoplus 1 mL，-20 ℃保存。提取所有受试者外周血2 mL，EDTA抗凝，淋巴细胞分离液分离提取白细胞，并保存于1 mL RNAisoplus中，-20 ℃保存。

1.4免疫组化检测Trem-1在寻常型银屑病皮损及正常皮肤组织中的表达采用免疫组化SP法，柠檬酸盐缓冲溶液热修复，Trem-1工作液浓度为1∶50，常规DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。用已知阳性切片做阳性对照，用山羊血清替代一抗或二抗为阴性对照。

1.5人血白细胞cDNA模板的制备含有1 mL RNAisoplus的人血白细胞，加入200 μL氯仿，离心后取上清，加入500 μL异丙醇，离心后弃上清，750 mL/L乙醇洗沉淀，DEPC水溶解。使用NanoDrop超微量检测分光光度计检测样品纯度及浓度。

1.6实时荧光定量PCR检测Trem-1 mRNA在寻常型银屑病与正常人的皮肤及血液中的表达逆转录产物于-20 ℃保存，用于Real-time PCR扩增。Trem-1上游引物：GGCAGATAATAAGGGACGGAGAG，下游引物：CATTCGGACGCGCAGTAAAC。反应体系为：2×SYBR Premix ExTaqTMII 10 μL，cDNA模板2 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，DEPC水6 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，总反应体积为20 μL。Real-time PCR反应条件：预变性，95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；重复40个循环；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。以管家基因β-actin为内源性参照。

1.7免疫组化及实时荧光定量PCR结果的判定免疫组化中每张切片随机取5个高倍视野(×400)，使用Image-Pro Plus软件计算每张图片IA值(累计吸光度)。实时荧光定量PCR采用相对定量法，Ct值是指PCR扩增过程中, 荧光信号进入指数增长阶段所对应的循环次数，ΔΔCt=(CtTrem-1-Ctβ-actin)银屑病组-(CtTrem-1-Ctβ-actin)正常对照组，利用2-ΔΔCt处理数据，该结果用于计算目的基因的相对含量。

2结果

2.1Trem-1在寻常型银屑病患者及正常人皮肤组织中的表达寻常型银屑病患者及正常皮肤组织中均见Trem-1表达。Trem-1在寻常型银屑病患者皮损中主要表达于表皮全层，棕黄色颗粒位于细胞胞质中，其IA值为46 006.22±12 419.14。Trem-1在正常皮肤组织中主要表达于基底细胞层，少量还可见于棘层细胞中，IA值为7 024.14±2 496.12(图1)。寻常型银屑病患者皮损中Trem-1表达水平显著高于正常皮肤组织，且差异具有统计学意义(t=9.98,P<0.05)。

图1Trem-1在寻常型银屑病皮损及正常皮肤组织中的表达

Fig.1 Expression of Trem-1 in psoriatic tissues and normal skin (SP, ×100)

A：寻常型银屑病皮损；B：正常皮肤组织。

2.2Trem-1 mRNA在寻常型银屑病患者及正常皮肤组织中的表达寻常型银屑病患者皮损部位Trem-1 mRNA相对表达量为1.58±0.49，正常人皮肤组织Trem-1 mRNA相对表达量为0.67±0.38，寻常型银屑病患者组织中Trem-1 mRNA较正常人显著升高，差异具有统计学意义(t=6.57,P<0.05)。寻常型银屑病皮损中Trem-1 mRNA表达量与PASI评分呈正相关(r=0.869，P<0.05，图2)。

图2寻常型银屑病皮损中Trem-1 mRNA相对表达量与PASI评分的相关线性

Fig.2 Expression of Trem-1 mRNA was positively correlated with PASI in psoriatic skin tissues

2.3Trem-1 mRNA在寻常型银屑病及正常人外周血中表达寻常型银屑病患者外周血中Trem-1 mRNA的相对表达量为1.77±0.34，正常人外周血Trem-1 mRNA相对表达量为1.03±0.33。寻常型银屑病患者外周血中Trem-1表达水平较正常人外周血显著升高，差异具有统计学意义(t=6.63,P<0.05)。寻常型银屑病患者血液中Trme-1 mRNA表达与PASI评分呈正相关(r=0.649，P<0.05，图3)。

图3寻常型银屑病患者血液中Trem-1 mRNA相对表达量与PASI评分的相关线性

Fig.3 Expression of Trem-1 mRNA was positively correlated with PASI in psoriatic blood

3讨论

寻常型银屑病是一种以红斑、鳞屑为主要特征的一种慢性难治性皮肤疾病，其发病机制尚不明确，与遗传、免疫、环境等多种因素相关。皮肤的感染或外伤可以促进易感个体银屑病皮损形成，近来研究证明局灶性感染在寻常型银屑病发病中起到重要作用[3]。

2000年BOUCHON 等[2]首次报道了Trem-1能触发及放大细菌感染后细胞因子级联反应。Trem-1是新型免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白，主要表达于中性粒细胞、单核细胞等细胞表面，其表达主要受细菌、真菌及细菌代谢产物脂多糖影响而上调。其天然配体未明确，通过与跨膜衔接蛋白DAP-12胞质区的免疫受体络氨酸活化基序(ITAM)向细胞内传递活化信号[4]，引发一系列下游信号转导，包括磷脂酶、ERK信号通路，同时增加细胞内钙离子动员并作用于核内，转录炎性细胞因子[5]。Trem-1还可活化NFκB信号通路，使ELK-1、NFAT、AP-1等因子活化，转录编码促炎因子的表达[6-7]。另外Trem-1也可通过JAK-STAT信号途径活化细胞核中靶基因启动子，诱导炎性相关因子表达；同时上调细胞表面黏附分子的表达，提高细胞与纤维结合蛋白、纤维蛋白原和血管细胞黏附，加速中性粒细胞及单核细胞向炎症部位迁移。Trem-1起了连接固有免疫及获得性免疫的作用，既参与了感染早期的诱导过程，又参与了获得性免疫应答的过程，调节Th1/Th2的免疫反应[1]。研究证实，活化Trem-1信号通路，可激活下游TNF-α、MCP、IL-8等前炎性因子，招募中心粒细胞和单核细胞向炎性部位渠化，诱导单核细胞分化成为未成熟的树突状细胞，后者可诱导T细胞增殖和分泌IFN-γ，同时抑制IL-10的分泌[8]，放大天然免疫及适应性免疫，加重炎症的发生。另一方面，GM-CSF和TNF-α可上调Trem-1的表达，抗炎因子IL-10也能下调Trem-1的表达。因此，Trem-1与下游因子形成正反馈的调节回路，促进炎症反应的级联放大。本课题初步研究了Trem-1与寻常型银屑病的关系，结果发现Trem-1在银屑病皮损中表达增加，Trem-1可能参与了寻常型银屑病的发生。这与HYDER研究结果一致[9]。本研究发现，Trem-1在寻常型银屑病患者外周血白细胞膜表面表达，且表达高于正常对照组。本结果与其他非感染性疾病，如消化性溃疡、急性胰腺炎等疾病研究结果相似，表明银屑病患者体内存在着Trem-1过度表达[10-11]。在银屑病发病过程中，微生物感染可导致中性粒细胞和单核细胞表面Trem-1表达升高，IL-8、MCP-1、TNF-α、IL-6等多种细胞因子的分泌，从而导致局部微血管的形成及表皮的增殖。

由于Trem-1具有激发和放大炎症反应的作用，因此阻断Trem-1在某些炎症性疾病中的高表达，在治疗疾病中起到一定作用。有研究发现，将Trem-1细胞外结构域和IgG-Fc的融合基因腺病毒重组体注入类风湿关节小鼠体内，小鼠体内炎性因子IL-17、TNF-α、IL-1β表达降低。阻断Trem-1可以降低炎性反应[12]。阻断Trem-1表达并不完全抑制机体的炎症反应，仍保留着部分抗感染的能力，因而Trem-1成为了理想的治疗靶点。研究证实，经过不同的临床治疗后，治疗有效组Trem-1的表达量明显低于治疗无效组[9]。因此，Trem-1可作为治疗寻常型银屑病的潜在靶位点[13]。

本研究比较了寻常型银屑病患者及正常人皮肤及血液中Trem-1表达差异，认为Trem-1可能在寻常型银屑病发病中起到重要作用，为寻常型银屑病的研究提供了新的思路。对于治疗前后Trem-1表达水平的动态变化，及相关信号通路激活还需进一步研究。

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(编辑卓选鹏)

Expression of Trem-1 and its significance in psoriasis vulgaris

TU Chen, WANG Shuang, ZHANG Yang, REN Jian-wen, WANG Xiao-peng, XIAO Sheng-xiang

(Department of Dermatology, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo study the expression of triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (Trem-1) in psoriatic vulgaris and normal skin tissues and blood, and to explore the potential pathogenesis of psoriasis. MethodsImmunohistochemistry and Real-time PCR were used to detect the expression of Trem-1 in the blood and tissues of normal skin and psoriasis. ResultsThe positive expression rate of Trem-1 in psoriatic lesion was significantly higher than normal tissue. Trem-1 was expressed in the whole epidermis, with a significant difference (P<0.05). The mRNA expression of Trem-1 was significantly higher in psoriatic skin tissues and blood than in normal skin tissues and blood (P<0.05). Moreover, the mRNA expression of Trem-1 was positively correlated with PASI (P<0.05). ConclusionAbnormal expression of Trem-1 might be related to the pathogenesis of psoriasis. Trem-1 will cure psoriasis vulgaris as the potential therapeutic target.

KEY WORDS:triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (Trem-1); psoriasis vulgaris; immunohistochemistry; Real-time PCR

收稿日期：2015-05-04 修回日期：2015-11-18

通讯作者：王晓鹏. E-mail: wxpdoctor@126.com

中图分类号：R758.63

文献标志码：A

DOI:10.7652/jdyxb201603026

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160411.1032.014.html(2016-04-11)