T0901317通过上调LXRα表达促进人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡*

涂　剑，　陆凯强，　丁维珂，　刘晓旺，　熊　婷，　刘　伶，　严　欣，　周志刚

(南华大学 1药物药理研究所， 2第一附属医院，湖南 衡阳 421001)



T0901317通过上调LXRα表达促进人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡*

涂剑1，陆凯强1，丁维珂1，刘晓旺1，熊婷1，刘伶1，严欣1，周志刚2△

(南华大学1药物药理研究所，2第一附属医院，湖南 衡阳 421001)

[摘要]目的： 观察肝X受体(LXR)激动剂T0901317对人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的作用及其机制。方法: 不同浓度(0、10、20、40 μmol/L)T0901317处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞不同时间(0、12、24、48 h)，用Hoechst 33342染色及流式Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡；Western blot进一步检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、cleaved caspase-3和LXRα的表达，RT-qPCR检测Bcl-2和LXRα的mRNA表达。结果: 随着T0901317处理浓度的增加和时间的延长，凋亡现象逐渐明显。进一步通过Western blot检测发现，T0901317可下调Bcl-2 蛋白表达，cleaved caspase-3表达增多，而LXRα的表达上调；RT-qPCR检测结果也显示，T0901317可下调Bcl-2 mRNA表达，而上调LXRα表达。结论: T0901317能上调LXRα表达，从而促进MDA-MB-231细胞凋亡。

[关键词]T0901317； 肝X受体α； MDA-MB-231细胞； 细胞凋亡

近年有研究指出，肝X受体(liver X receptor, LXR)激动剂T0901317可抑制多种肿瘤包括乳腺癌细胞的增殖[1-4]。另有文献提出，T0901317还能诱导前列腺癌和黑色素瘤细胞凋亡[5-6]。那么，T0901317对乳腺癌细胞凋亡的作用和机制如何？虽有文献提示[7]，迄今未见具体报道。本研究主要围绕T0901317对人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响展开。

材料和方法

1材料

MDA-MB-231细胞购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心；T0901317为Cayman产品；Hoechst 33342和β-actin的 I抗购自Sigma；Annexin V-FITC/PI试剂盒来自Becton-Dickinson；LXRα的 I 抗(Epitomics)；Bcl-2、caspase-3和cleaved caspase-3的 I抗(CST)； II 抗均购自联科生物公司；TRIzol购自Invitrogen；cDNA逆转录试剂盒购自Thermo；LXRα、Bcl-2和β-actin引物由上海生工合成。

2方法

2.1Hoechst 33342染色检测细胞凋亡浓度分别为0、10、20和40 μmol/L的T0901317处理细胞24 h，4%多聚甲醛固定。Hoechst 33342染色液室温下避光孵育，封片后用荧光显微镜观察、拍照。

2.2流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡分别加入浓度为0、10、20和40 μmol/L的T0901317处理MDA-MB-231细胞不同时间(0、12、24、48 h)，PBS清洗、回收至相应流式管内。加入不含EDTA的0.25%的外用胰酶消化，吹打后的悬液吸入对应的流式管中，稍混匀。1 800 r/min离心3 min，预冷PBS重悬细胞，重复2次。1 500 r/min离心5 min，弃上清，每管加入195 μL Annexin V-FITC buffer轻重悬细胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染液轻柔混匀。室温避光孵育20 min，冰浴后迅速使用流式细胞仪检测样品，Annexin V-FITC激发绿色荧光而PI则激发红色荧光。

2.3Western blot法检测细胞中LXRα、Bcl-2、caspase-3和cleaved caspase-3的蛋白水平收集各组细胞，蛋白定量后加入适量5×上样缓冲液，沸水煮10 min，积层胶80 V、分离胶120 V电泳后湿转至PVDF膜。室温封闭约2 h，分别加入 I 抗4 ℃过夜，TBST洗涤3次；再加入 II 抗，37 ℃孵育0.5 h，TBST洗涤4次；用Western blot荧光检测试剂盒显影，以内参为对照，扫描结果进行半定量分析。

2.4RT-qPCR检测LXRα和Bcl-2的mRNA含量按照试剂盒说明书采用TRIzol溶液提取各组细胞总RNA，按逆转录试剂盒程序得到相应的cDNA。LXRα的上游引物序列为5’-TCTGGAGACATCTCGGAGGTACAAC-3’，下游引物序列为5’-AGCAAGGCAAACTCGGCATC-3’；Bcl-2上游引物序列为5’-CTGCACCTGACGCCCTTCACC-3’，下游引物序列为5’-CACATGACCCCACCGAACTCAAAGA-3’。加cDNA 0.1 μL，相应基因上、下游引物各1 μL，用无酶水补齐至20 μL，使用95 ℃30 s;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40个循环，进行qPCR扩增。根据Ct值，使用2-ΔΔCt法统计结果。

3统计学处理

实验所得数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0进行统计处理，组间比较采用单因素方差分析及t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1T0901317对MDA-MB-231细胞凋亡的影响

与control组比较，随着T0901317处理浓度的增加，细胞核发生固缩，核膜溶解，细胞核明显缩小甚至碎裂，形态呈不规则状，荧光不均且强度变大，部分细胞可观察到凋亡小体，尤以20 μmol/L和40 μmol/L的T0901317处理细胞组更为明显，见图1A。

流式结果显示，T0901317处理MDA-MB-231细胞 12 h后，与control组相比，20 μmol/L以及40 μmol/L组出现了凋亡，而处理24 h以及48 h发现20 μmol/L以及40 μmol/L组的凋亡更明显，活细胞总数下降,见图1B。上述结果提示，T0901317可随浓度的增加和时间的推移明显诱导MDA-MB-231细胞凋亡。

Figure 1.The effect of T0901317 on the apoptosis of MDA-MB-231 cells. A: Hoechst 33342 staining (×200); B: Annexin V/propidium iodide staining and flow cytometry.

图1T0901317对MDA-MB-231细胞凋亡的影响

2T0901317对MDA-MB-231细胞中凋亡相关蛋白和LXRα蛋白水平的影响

Western blot结果显示，随着T0901317处理浓度的增加，与0 μmol/L组相比，LXRα蛋白表达逐渐增强，Bcl-2蛋白表达逐渐减弱，cleaved caspase-3蛋白量增加明显，差异具有统计学显著性(P<0.05)。随着T0901317处理时间的延长，与0 h组相比，LXRα蛋白表达逐渐增强，Bcl-2蛋白表达下降，但是cleaved caspase-3的蛋白量明显增加，差异有统计学显著性(P<0.05),见图2。以上结果说明随着T0901317孵育浓度的增加和时间的延长，可明显促进MDA-MB-231细胞凋亡。

Figure 2.The effect of T0901317 on the protein levels of LXRα and apoptosis-related proteins， such as Bcl-2 and cleaved caspase-3， in MDA-MB-231 cells detected by Western blot. Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P< 0.01 vs 0 μmol/L or 0 h.

图2T0901317对MDA-MB-231细胞中LXRα和凋亡相关蛋白Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白水平的影响

3T0901317对MDA-MB-231细胞中LXRα和Bcl-2 mRNA表达的影响

RT-qPCR结果显示，与control组相比，随着T0901317处理浓度的增加，LXRα 的mRNA水平明显增高，Bcl-2的 mRNA表达明显降低。与0 h组相比，随着T0901317处理时间的延长，LXRα的mRNA水平明显增高，Bcl-2的mRNA表达明显降低，差异具有统计学显著性(P<0.05)，见图3。这说明T0901317能上调LXRα的mRNA水平，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA表达。

Figure 3.The effect of T0901317 on the mRNA expression of LXRα and Bcl-2 in MDA-MB-231 cells detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs 0 μmol/L or 0 h.

图3T0901317对MDA-MB-231细胞中LXRα和Bcl-2 mRNA表达的影响

讨论

乳腺癌的发病机理至今仍未阐明，诱导乳腺癌细胞凋亡可作为生物治疗的一种有效手段[7-9]。而T0901317能否诱导乳腺癌细胞凋亡，成为乳腺癌防治的新药？El Roz 等[7]2012年报道，MCF-7细胞中激动LXR可促进细胞内胆固醇流出，抑制细胞增殖，略有提示检测了其间细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的基因表达。据此，我们围绕T0901317对乳腺癌细胞凋亡的影响做了系统的检测。

不仅MCF-7细胞，针对MDA-MB-231细胞，我们运用Hoechst 33342染色和流式Annexin V-FITC/PI双染法检测，结果均发现随着T0901317处理浓度的增加，活细胞总数下降，细胞核发生固缩甚至碎裂，荧光不均且强度变大，可观察到凋亡小体。

半胱天冬酶(caspase)在正常细胞处于非活化的酶原状态；被活化后，可经凋亡蛋白酶的层叠级联反应，发生不可逆的凋亡[10]。Caspase-3在caspase家族中是数条细胞凋亡信号通路的下游聚点，一般为最后决定其细胞死亡的关键蛋白激酶，可作为凋亡发生的观察指标之一[11-12]。而Bcl-2蛋白属于 Bcl-2 蛋白家族抗凋亡蛋白[13]。我们的检测结果显示，Bcl-2蛋白表达下降，caspase-3蛋白的表达量不变或略为增加，cleaved caspase-3蛋白量明显增加，说明caspase-3被激活。进一步提示T0901317随孵育细胞浓度的增加和时间的延长，明显促进乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡。

凋亡过程受到多种细胞内外因素的调节，其中NF-κB通路在炎症、细胞增殖及凋亡等过程中均发挥着重要的调控作用[14-15]。有研究表明，NF-κB可以调控多种与凋亡相关的基因转录，抑制细胞凋亡[16]。且NF-κB抑制细胞凋亡主要是上调拥有相应结合位点的抗凋亡基因(如Bcl-2)的表达[17]。T0901317是肝X受体人工合成激动剂，尤其对LXRα具有高亲和力。我们的实验结果也证实，T0901317上调了LXRα的mRNA和蛋白表达。我们另有结果发现，T0901317可下调乳腺癌细胞中NF-κB p65的表达[18]，而生物信息学分析提示，人LXRα序列含有NF-κB的结合位点[19]。这是否提示T0901317促使乳腺癌细胞凋亡的机制可能通过LXRα/NF-κB p65/Bcl-2途径。接下来我们将进一步通过激动剂和阻断剂的应用探讨T0901317诱导乳腺癌细胞凋亡的可能机制。

综上所述，我们认为T0901317能上调LXRα的表达，诱导MDA-MB-231细胞凋亡。

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(责任编辑： 卢萍， 罗森)

T0901317 induces apoptosis of human breast cancer MDA-MB-231 cells by up-regulating LXRα expression

TU Jian1, LU Kai-qiang1, DING Wei-ke1, LIU Xiao-wang1, XIONG Ting1, LIU Ling1, YAN Xin1, ZHOU Zhi-gang2

(1Institute of Pharmacy and Pharmacology，2The First Affiliated Hospital, University of South China, Hengyang 421001, China. E-mail: zhouzhigang0734@sina.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the pro-apoptotic effect of T0901317, an artificial agonist of liver X receptor α (LXRα), on human breast cancer MDA-MB-231 cells and its mechanism. METHODS: MDA-MB-231 cells were treated with different concentrations (0, 10, 20 and 40 μmol/L) of T0901317 for different time (0, 12, 24 and 48 h). The cell apoptosis was determined by Annexin V/propidium iodide staining and Hoechst 33342 staining. The expression of apoptosis-related proteins, such as Bcl-2, caspase 3 and cleaved caspase-3, and LXRα was determined by Western blot. The mRNA expression of Bcl-2 and LXRα was analyzed by RT-qPCR. RESULTS: T0901317 induced the cell apoptosis in a dose-and time- dependent manner. The expression of cleaved caspase-3 and LXRα was up-regulated, but Bcl-2 was down-regulated by T0901317. The mRNA expression of Bcl-2 was down-regulated, while LXRα was up-regulated by T0901317.CONCLUSION: T0901317 up-regulates LXRα expression and induces the apoptosis of MDA-MB-231 cells.

[KEY WORDS]T0901317; Liver X receptor α; MDA-MB-231 cells; Apoptosis

[文章编号]1000- 4718(2016)05- 0836- 05

[收稿日期]2015- 12- 21[修回日期] 2016- 02- 23

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81541163); 湖南省自然科学基金资助项目(No. 2015JJ3101); 湖南省教育厅创新平台项目(No. 15K111);“湖南省分子靶标新药研究协同创新中心”培育项目(No. 2014-405)

[中图分类号]R730.23

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.011

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者Tel: 0734-8578508; E-mail: zhouzhigang0734@sina.com