螺内酯对实验性矽肺小鼠的干预研究*

向国安，　苏程程，　张译丹，　马永强，　周　欣，　魏路清，　姬文婕

(1中国人民武装警察部队后勤学院附属医院呼吸与重症医学科，天津 300162； 2中国人民武装警察部队福建总队医院，福建 福州 350000；3中国人民武装警察部队后勤学院附属医院心脏中心，心血管病研究所，天津 300162)



螺内酯对实验性矽肺小鼠的干预研究*

向国安1▲，苏程程1▲，张译丹2，马永强3，周欣3，魏路清1△，姬文婕1△

(1中国人民武装警察部队后勤学院附属医院呼吸与重症医学科，天津 300162；2中国人民武装警察部队福建总队医院，福建 福州 350000；3中国人民武装警察部队后勤学院附属医院心脏中心，心血管病研究所，天津 300162)

[摘要]目的： 探讨螺内酯(spirolactone，SPI)在实验性小鼠矽肺病理进展中的作用及机制。方法: 将120只雄性C57 BL/6小鼠(18～20 g)随机分为生理盐水组(NS组)、石英组(quartz组)、石英+生理盐水组(quartz+NS组)和石英+螺内酯组(quartz+SPI组)，经口咽吸入石英混悬液建立实验性小鼠矽肺模型；quartz+SPI组及quartz+NS组每天分别经灌胃给予螺内酯10 mg/kg或等体积的生理盐水。术后3 d、14 d和28 d处死小鼠，行常规支气管肺泡灌洗术，回收支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)进行细胞分类和计数；采用ELISA法检测BALF上清中转化生长因子β1(TGF-β1)的含量；采用HE染色、Masson染色和免疫荧光染色观察肺组织病理学变化及纤维化程度；采用RT-qPCR检测各组肺组织中胶原I(Col I)、胶原III(Col III)及TGF-β1的mRNA表达水平。结果: 经口咽吸入石英后，小鼠肺组织经历了典型的急性炎症期和纤维化期改变，给予SPI干预后的小鼠肺组织炎症反应程度相比于quartz+NS组减轻(P<0.05)。给予螺内酯干预后，在第3天小鼠肺组织TGF-β1 的mRNA表达量显著下调(P<0.01)，BALF中TGF-β1的含量也显著减少(P<0.01)。到第28天，quartz+SPI组小鼠肺组织Col I、Col III的mRNA表达量明显低于quartz+NS组(P<0.05)。结论: SPI可能通过调控TGF-β1的mRNA表达，减少TGF-β1蛋白的分泌，从而改善石英导致的早期急性炎症反应，并在纤维化期减轻了Col I和Col III的mRNA表达，抑制了纤维化的进展。

[关键词]石英； 肺纤维化； 螺内酯； 转化生长因子β1

矽肺是由于长期吸入大量游离石英粉尘所引起，以肺部广泛性结节性肺纤维化为主要特征的疾病。矽肺病理发展呈不可逆性，脱离暴露因素后患者肺功能仍进行性恶化，目前尚无有效治愈方法[1-3]。近年来研究发现，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)不仅参与内环境稳态调节，还在肺组织炎症、修复和纤维化过程中起到重要作用。作为典型的胞核甾体类激素受体，盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor，MR)在多个靶器官系统的促炎症和促纤维化作用越来越被重视，螺内酯(spirolactone，SPI)是公认的MR拮抗剂。选择性敲除单核巨噬细胞系MR，能够减轻慢性盐皮质激素导致的心肌纤维化[4]。本研究采用实验性小鼠矽肺模型， 探讨MR拮抗剂SPI对石英诱导小鼠肺纤维化的影响，并明确其对实验性矽肺肺损伤炎症反应及纤维化的作用及分子机制。

材料和方法

1动物

SPF级雄性C57BL/6小鼠，18～20 g，购自解放军军事医学科学院实验动物中心，许可证号为SCXK-(军)2012-0004。实验前小鼠均适应性饲养1周。饲养环境实施12 h/12 h明暗周期，保持恒定通风、温度和湿度。

2主要试剂

游离石英粉尘和螺内酯(Sigma)；TRIzol Reagent (Invitrogen)；MMLV反转录酶和dNTPs(Promega)；SYBR Green 实时定量PCR试剂盒(Roche)；转化生长因了β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；其余国产试剂均为分析纯。所用引物由北京鼎国昌盛生物技术有限公司根据设计合成。

3主要方法

3.1小鼠矽肺模型的制备、标本的采集与处理120只雄性C57BL/6小鼠随机分为生理盐水组(NS组)、石英组(quartz组)、石英+生理盐水组(quartz+NS组)和石英+螺内酯组(quartz+SPI组)，经2%异氟烷麻醉后，采取经口咽吸入法建立实验性矽肺模型，quartz组按100 mg/kg剂量给予石英混悬液40 μL，待小鼠完全吸入并苏醒后常规饲养；NS组吸入同等体积的无菌生理盐水；模型制备完成后quartz+SPI组和quartz+NS组还需分别按每日10 mg/kg的剂量经灌胃给予SPI或等体积的无菌生理盐水。在术后第3天、14天、28天麻醉后处死小鼠，血浆分装保存于-80 ℃备用。每个时点每组取5只小鼠行经支气管肺泡灌洗术，回收支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)后进行细胞计数和分类，上清分装后置于-80 ℃保存。未灌洗的小鼠左肺用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，右肺冻存于液氮中用于提取RNA。

3.2病理学分析小鼠肺组织经固定、石蜡包埋、连续切片(3 μm～5 μm)后，采用HE染色观察炎症反应，用炎症评分(inflammation score，IS)代表炎症反应程度；采用Masson染色及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)免疫荧光检测胶原纤维含量，用胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)代表纤维化程度。

3.3BALF细胞计数和分类BALF回收后经4 ℃、3 000 r/min离心15 min，用D-Hanks液重悬细胞团，采用Countstar自动细胞计数仪计数，甩片后经4 ℃无水乙醇固定30 min、HE染色，普通光学显微镜下连续计数200个细胞，统计巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞的比例。上清分装保存于-80 ℃备用。

3.4ELISA检测BALF上清中TGF-β1的含量严格按照TGF-β1 ELISA试剂盒操作说明进行BALF上清中TGF-β1含量的检测及建立标准曲线。简述步骤如下，每个待测样品涡旋混匀后取100 μL进行检测，采用酶标仪分别在450 nm 和630 nm处测吸光度(A)值，最终使用两种A值之差(A492-A630)进行分析。

3.5RT-qPCR检测肺组织中mRNA的表达水平采用Trizol Reagent试剂盒分离纯化第3天和第28天各组肺组织的总RNA，分光光度法测定计算提取的总RNA含量及浓度。参照OneStep Real-Time PCR试剂盒推荐的标准操作步骤，在ABI 7300荧光定量PCR仪上进行RT-qPCR，内参照使用β-actin，扩增条件为95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40个循环。根据GenBank 数据库中目的基因cDNA 序列，使用Primer Premier 6.0 软件设计特异性引物，由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成(表1)，使用2-ΔΔCt法对RT-qPCR结果进行分析。

表1　引物序列

4统计学处理

采用STATA 14.1软件进行统计分析。正态分布计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，采用单因素方差分析和SNK法两两比较。不满足正态性或方差齐性，以中位数、四分位间距描述原始数据，并采用非参数秩和Mann-Whitney检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1小鼠肺组织病理学变化

普通光学显微镜下可见NS组肺组织结构基本正常，未见明显的炎症细胞浸润和胶原纤维沉积。与NS组相比，quartz组及quartz+NS组的小鼠在第3天可见肺组织有大量炎性细胞浸润，肺泡间隔水肿增厚，可见部分肺泡腔陷闭，IS明显高于NS组(P<0.01)，给予盐皮质激素受体拮抗剂SPI干预的quartz+SPI组炎性细胞浸润及肺泡腔增厚与quartz组及quartz+NS组相比较轻，肺泡结构相对完整，IS低于quartz+NS组，差异均有统计学显著性(P<0.05)。随着时间的进展， Masson染色和α-SMA免疫荧光染色结果显示， quartz组和quartz+NS组肺组织在第28天均出现成纤维细胞增殖、胶原沉积，并可观察到纤维结节及大量致密蓝染胶原纤维或大量α-SMA阳性区域，该2组的CVF值均显著高于NS组(P<0.01)；与quartz+NS组比，给予盐皮质激素受体拮抗剂SPI干预的quartz+SPI组肺部病变减轻，CVF显著低于quartz+NS组(P<0.01)，见图1、2。

Figure 1.Spironolactone reduced quartz-induced alveolitis (A), and the synthesis and secretion of TGF-β1 (B) were down-regulated. Mean±SD. n=5.**P<0.01 vs NS group;#P<0.05,# #P<0.01 vs quartz+NS group.

图1螺内酯减轻了石英诱导的肺泡炎症，下调了TGF-β1的合成与分泌

Figure 2.Spironolactone attenuated quartz-induced pulmonary fibrosis. A: Masson’s trichrome staining and the immunofluorescent staining of α-SMA (FITC-labeled, green; nuclei were counterstained by DAPI); B: the mRNA expression of Col I and Col III in the lung tissues on day 28 after quartz challenged. Mean±SD. n=5.**P<0.01vsNS group;##P<0.01vsquartz+NS group.

图2螺内酯减轻石英诱导的肺纤维化

2BALF细胞计数和分类比较

与NS组相比，quartz和quartz+NS组小鼠BALF细胞总数在第3、14天均明显升高。而quartz+SPI组小鼠BALF细胞总数明显低于quartz+NS组，并且中性粒细胞数变化也呈相同趋势。在急性炎症期(第3天)，quartz+SPI组小鼠BALF的巨噬细胞数略低于quartz+NS组，差异无统计学显著性；第14天，quartz+NS组的巨噬细胞数明显增高，而给予SPI干预的小鼠巨噬细胞数明显少于quartz+NS组(P<0.05)，见表2。由此推测，SPI可减轻急性期和纤维化期肺泡炎性细胞浸润。

表2　3 d和14 d各组肺泡灌洗液细胞计数分类结果的比较

**P<0.01 vs NS group;#P<0.05,##P<0.01 vs quartz+NS group.

3SPI下调TGF-β1的mRNA表达水平及蛋白合成

染尘后第3天，与NS组相比较，quartz 组及quartz +NS组小鼠肺BALF上清中的TGF-β1 含量及肺组织中TGF-β1的mRNA表达水平均呈一致性升高(P<0.05)；而经灌胃给予SPI的quartz+SPI组小鼠肺BALF上清中的TGF-β1 含量及肺组织中TGF-β1 的mRNA表达水平相对于quartz +NS组明显降低(P<0.05)，见图1。

4小鼠肺组织中Col I和Col III的mRNA表达

造模后第28天quartz小鼠肺组织Col I和Col III的mRNA表达量较NS组明显升高，然而，quartz+SPI组小鼠肺组织Col I和Col III的mRNA表达量均低于quartz+NS组(P<0.05)，由此看出，给予SPI干预可以抑制石英刺激后小鼠肺组织Col I和Col III的mRNA的表达升高，见图2。

讨论

近年来研究报道显示，RAAS活性增高在慢性心血管和其它疾病的炎症和重塑病理学机制中起了很重要的作用，同时也是肺损伤的发病机制中重要因素之一[5-6]。作为RAAS的效应环节，醛固酮涉及到多类纤维化相关的慢性炎症疾病的发病机制[7-8]。目前巨噬细胞MR在石英诱发的急性肺损伤和肺纤维化中的作用尚不明确。

TGF-β1是公认的促进纤维化形成和发展的关键性细胞活性物质，其在肺纤维化中发挥了至关重要的作用。大量研究表明TGF-β1通过促进成纤维细胞的增殖、聚集以及转换为成肌纤维细胞表型，从而参与了细胞外基质蛋白的沉积，这是肺纤维化的形成的重要机制之一。Neveu等[9]的新近研究表明，TGF-β1可通过修饰肺成纤维细胞中胸腺细胞分化抗原1(Thy-1)的表达，加重特发性肺纤维化的程度。TGF-β1还可通过促进肺成纤维细胞产生ROS，进而导致JNK的激活以及Col I、Col III的合成[10]。另有研究表明，游离石英粉尘在大鼠矽肺模型中通过刺激肺组织可引起大鼠血清中含量的增加，且表明TGF-β1合成与分泌在炎症期和纤维化期起了重要作用[11]。阻断MR能够减轻博来霉素诱发的纤维化的现象已经被广泛认可[12-14]，我们实验室的前期研究也证明了SPI减轻博来霉素诱发的肺纤维化可能是通过影响MCP-1 和TGF-β1的表达来实现的[15]。SPI作为一种利尿药物，在临床已广泛使用，我们由此受到启发去进一步探索SPI在治疗游离石英粉尘诱导的肺纤维化中作用。

在本研究中，采用经口咽吸入游离石英粉尘建立小鼠实验性矽肺模型，灌胃给予SPI干预实验性矽肺小鼠。通过研究我们发现，经SPI干预后实验性矽肺小鼠急性肺组织炎症反应和肺组织胶原纤维的沉积都得到了缓解，肺纤维化的病理进展得到了抑制，同时，小鼠肺组织中TGF-β1mRNA和蛋白的表达水平也都下调。这与本实验室前期研究中发现SPI能减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的结果是相一致的。肺巨噬细胞是石英颗粒作用的主要靶细胞，IFN-γ和TNF-α或LPS可诱导产生M1型巨噬细胞，随之释放大量ROS、NO及促炎细胞因子，引起过度的炎症反应与组织损伤，最终激发了纤维化；而M2型巨噬细胞则分泌大量抗炎因子如IL-4、IL-10和IL-13，主要有下调炎症反应与启动损伤修复的作用，并在控制细胞增殖、胶原沉积和组织修复中发挥了关键的作用[16]。同时，有报道显示石英可通过上调肺泡巨噬细胞和成纤维细胞中TGF-β1的表达, 增加胶原合成而参与矽肺纤维化的发展[17]。我们接下来拟通过体内外实验，进一步探讨巨噬细胞表型偏移在通过阻断MR抑制石英诱导的纤维化进展中的作用及其作为潜在肺纤维化预防和治疗靶点的可能性。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Effect of spirolactone on mouse model of experimental silicosis

XIANG Guo-an1, SU Cheng-cheng1, ZHANG Yi-dan2, MA Yong-qiang3, ZHOU Xin3, WEI Lu-qing1, JI Wen-jie1

(1DepartmentofRespiratoryMedicineandIntensiveCareUnit,HospitalAffiliatedtoLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForces,Tianjin300162,China；2FujianPeople’sArmedPoliceCorpsHospital,Fuzhou350000,China;3CardiacCenter,InstituteofCardiovascularDiseases,HospitalAffiliatedtoLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForces,Tianjin300162,China.E-mail:ji_wenjie@hotmail.com;wei-luqing@hotmail.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of spirolactone (SPI) in the progression of quartz-induced experimental silicosis mouse model. METHODS: Male C57BL/6 mice (n=120, 18～20 g) were randomly divided into normal saline (NS) group, quartz group, quartz+SPI group and quartz+NS group. Oropharyngeal aspiration of quartz suspension was performed to make model. The mice in quartz+SPI group and quartz+NS group were treated with SPI (10 mg /kg) or the same volume of NS daily by oral gavage throughout the experiment. The mice were sacrificed following anesthesia on days 3, 14 and 28 after treatment. The total number and different types of bronchoalveolar lavage fluid (BALF)-derived cells were routinely counted. HE staining, Masson’s trichrome staining and immunofluorescent staining were used to conduct histopathologic examination. The mRNA expression levels of collagen I (Col I), collagen III (Col III) and transfor-ming growth factor-β1(TGF-β1) were examined by real-time PCR. The content of TGF-β1 in BALF was measured by ELISA. RESULTS: The classical pathological stages of quartz-induced lung injury, including acute inflammation phase (3 d), progressive fibrosis phase (14 d) and late fibrosis phase (28 d), were observed. Compared with quartz+NS group, the inflammatory responses of the lungs in quartz+SPI group were attenuated in the acute inflammation phase, and the degree of fibrosis was significantly reduced at 28 d after the inspiration of quartz. After the treatment with SPI, the mRNA expression of Col I, Col III and TGF-β1 in the lung tissues was effectively down-regulated. Meanwhile, the content of TGF-β1 in BALF was reduced. CONCLUSION: Treatment with SPI may significantly attenuates quartz-induced early inflammatory responses of the lung tissues by regulating the mRNA expression of TGF-β1 and secretion of TGF-β1 protein, and reduces the mRNA expression of Col I and Col III at fibrotic phase, resulting in the inhibition of the progression of fibrosis.

[KEY WORDS]Quartz; Lung fibrosis; Spirolactone; Transforming growth factor-β1

[文章编号]1000- 4718(2016)05- 0947- 06

[收稿日期]2016- 02- 22[修回日期] 2016- 03- 29

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81570335； No. 81441101)；武警后勤学院附属医院项目(No. FYJ201510； No. FYZ201402； No. FYZ201538)

通讯作者△姬文婕 Tel: 022-60577283; E-mail: ji_wenjie@hotmail.com； 魏路清 Tel： 022-60578671； E-mail： wei_luqing@hotmail.com

[中图分类号]R363

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.031

杂志网址： http://www.cjpp.net

▲并列第1 作者