广东地区感染养殖罗非鱼的无乳链球菌分子分型研究*

方 伟，梁宇恒，宁 丹，柯碧霞，柯昌文，邓小玲，彭华林，孙九峰，王云新

(1. 广东省水生动物疫病预防控制中心，广东 广州 510222;2. 广东省疾病预防控制中心，广东 广州 511430;3. 广东省公共卫生研究院，广东省疾病预防控制中心，广东 广州 511430)

广东地区感染养殖罗非鱼的无乳链球菌分子分型研究*

方 伟1，梁宇恒2，宁 丹3，柯碧霞2，柯昌文2，邓小玲2，彭华林1，孙九峰3，王云新1

(1. 广东省水生动物疫病预防控制中心，广东 广州 510222;2. 广东省疾病预防控制中心，广东 广州 511430;3. 广东省公共卫生研究院，广东省疾病预防控制中心，广东 广州 511430)

以广东省内5个罗非鱼Oreochromisniloticus主要养殖区内分离的无乳链球菌Streptococcusagalactiae为研究目标，通过毒力基因PCR检测、多位点序列分型、脉冲场凝胶电泳技术研究广东地区感染罗非鱼的无乳链球菌分子特征。结果发现170株分离无乳链球菌中毒力基因的携带率介于60.59%～100%之间，毒力基因携带形成10个谱系，dltR-bca-sodA-spb1-cfb-bac(38.24%， 65/170)，dltr-bca-sodA-spb1-bac(23.53%，40/170)和dltr-bca-sodA-spb1-cfb-bac-scpB(22,35%，38/170)为主要的谱系，dltr-bca-sodA-spb1-bac-scpb(8.24%，14/170)和dltr-bca-sodA-spb1(4.71%， 8/170)次之。多位点序列分型研究证实170株菌在7个位点均为单一的等位基因，为adhP(10), pheS(1), atr(2), glnA(1), sdhA(3), glcK(2), tkt(2)，序列型为ST7型。146株菌脉冲场凝胶电泳结果表明146株菌分为6个簇(A-D，F，G)，相似性介于86%～100%之间。A(18)，B(16)，C(103)，D(7)为主要的遗传簇，占菌株数的98.63%(144/146)。基因簇A，C在4个采样区均有发现；基因簇B分布在吴川、茂名和阳江；基因簇D分布在茂名、珠海和阳江；基因簇F和G分别来自茂名和珠海。在A-D遗传簇中均有发现来自不同地区的菌株呈现100%的相似性，为同一克隆株。结果表明广东省主要罗非鱼养殖区内感染链球菌携带毒力基因比率高，序列型均为高致病的ST7型别，不同地区间具有相同的PFGE型别，不同地区间交叉传播感染的可能高。

罗非鱼Oreochromisniloticus; 无乳链球菌Streptococcusagalactiae; 毒力基因; MLST; PFGE

无乳链球菌Streptococcusagalactiae属于B群链球菌(Group BStreptococcus，GBS)，是一种广泛分布于自然界的革兰氏阳性菌，根据其荚膜多糖抗原性的不同，可分为10种血清型(Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅸ型)，可引起人类的败血症、肺炎及脑膜炎等疾病[1-2]，也是引起罗非鱼Oreochromisniloticus链球菌病主要病原菌[3-6]。

2008年之前，广州地区引起罗非鱼感染的链球菌多为海豚链球菌。2009年广东暴发无乳链球菌感染，其后，无乳链球菌成为主要病原菌。2008 年张新艳等[7]首次报道无乳链球菌为广州某养殖场罗非鱼暴发病的病原菌，并对该病原菌分离鉴定及致病性进行了研究；卢迈新等[8]在海南省发病的罗非鱼中分离到无乳链球菌；随后柯剑、张俊等[9-10]分别对广州地区罗非鱼感染链球菌进行了病原学检测及初步的分析，均表明无乳链球菌是罗非鱼链球菌病的重要病原菌。2012年郭玉娟[11]对我国南方地区罗非鱼无乳链球菌进行了分子流行病学研究，结果表明：罗非鱼感染链球菌在不同地区具有相同的血清型、MLVA分型及表面C蛋白，与对照组牛源的无乳链球菌有明显的差异，因而推测我国南方地区鱼源无乳链球菌未发生明显的变异。已有的研究已经部分阐明了广东部分地区流行的菌株种类、血清型、耐药特征，但大多的研究结果仅基于少量菌株，因而对系统阐明广东地区无乳链球菌流行特征仍缺乏说服力[7-11]。本中心研究人员依托广东省鱼病监测系统，采集广东省多个罗非鱼养殖场的发病鱼样本，通过病原菌的分离、理化与分子鉴定已分离到多株无乳链球菌菌株，本研究应用毒力基因携带情况检测、多位点序列分型、脉冲场凝胶电泳分型技术开展感染罗非鱼的无乳链球菌分子流行病学研究，为阐明该菌的群体组成，在广东地区的流行规律奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株来源、试验材料及设备仪器

2014年8-12月，从广东茂名、肇庆、吴川、珠海和阳江市多个罗非鱼养殖场采集健康罗非鱼样本206份，鱼体质量1～2 kg。细菌分离培养获得无乳链球菌170株，所有菌株均经过生理生化、特异性PCR扩增、血清型鉴定(Ia)[12]。

血琼脂平板及其他常用试剂等购自广州市迪景微生物科技有限公司；PCR反应GoTaq试剂购自美国Promega公司、DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司、DL2000 DNA分子标准试剂购自大连宝生物科技有限公司、琼脂糖凝胶购自美国Cambrex公司。

研究中所用到的主要仪器包括脉冲场凝胶电泳购自美国Bio-Rad公司，培养箱购自美国shellab公司、金属浴购自美国eppendorf公司、PCR仪及凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 毒力基因检测

[13]，应用PCR法检测无乳链球菌毒力基因：表面定位蛋白GBS(spb1)、C5a肽(scpB)、C蛋白apha亚基(bca)、C蛋白beta亚基(bac)、调节蛋白(dltR)、CAMP因子(cfb)、超氧化物歧化酶(sodA)。挑取经划线培养的单菌落菌株，参考试剂盒说明提取菌体基因组DNA。PCR 模板为细菌基因组DNA，PCR终反应体系: 总反应体系为25 μL，包括2 × PCR Mix 12.5 μL，10 pmol/L引物各1 μL(表1)，其余以无菌水补齐。PCR 反应条件见表1。PCR 产物w=1%琼脂糖凝胶电泳后观测并拍照。

1.3 多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing，MLST)

链球菌多位点序列分型参照MLST链球菌公用数据库资料(http:∥pubmlst.org)[14]，通过PCR扩增乙醛脱氢酶(adhP)、苯丙氨酰-tRNA合成酶(pheS)、氨基酸转运子(atr)、谷氨酸合成酶(glnA)、丝氨酸脱氢酶(sdhA)、葡萄糖激酶(glcK)、转酮醇酶(tkt)7个基因，并进行测序、网上比对分析。PCR扩增及测序引物见表2，PCR扩增程序及反应体系如下：总反应体系为25 μL，包括2 × PCR Mix 12.5 μL，10 pmol/L引物各1 μL(表1)，其余以无菌水补齐。PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min，35个循环( 94 ℃变性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min) ，72 ℃终延伸10 min，4 ℃保持。PCR 产物w=1%琼脂糖凝胶电泳，结果阳性送深圳华大基因公司测序。测序结果经DNA Star软件包中Seqman软件处理后，进行在线逐一比对所属的序列型。

表1 无乳链球菌毒力基因检测引物及PCR扩增条件

1.4 脉冲场凝胶电泳分型

参照已有文献资料脉冲场凝胶电泳(Pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)操作方法[15]。纯化的单菌落接种血培养平板，过夜培养后收集菌体，以缓冲液洗涤菌体两次(Tris-HCl 0.01 mol/L, EDTA 0.1 mol/L , pH 8.0)；菌体在含有1.0 mg/mL的溶菌酶和1.0 mg/mL的蛋白酶K溶液中消化，然后与等体积的w=1%低熔点琼脂混合制备胶块；胶块在含有12U的SmaⅠ内切酶中消化(50 mmol/L Tris, 50 mmol/L EDTA,w=1% SDS, 0.1 mg/mL protein K)，消化后的胶块上机电泳。电泳条件：电泳方向转换时间4 s，40 s，电泳时间20 h，泳动角度120°，电压6 V/cm(CHEF Mapper XA，Bio-Rad, USA)。PFGE结果在BioNumerics 6.5(Applied Maths BVBA, Belgium)软件分析，具体建树分析参数参照文献进行，以非加权的几何平均数(unweighted pair group method using arithmetic averages, UPGMA)方法建树，采用基于条带比较的Dice系数衡量PFGE带型之间的相似度。

2 结 果

2.1 毒力基因检测

170株分离无乳链球菌中表面定位蛋白GBS(spb1)携带率98.24%(167/170)、C5a肽(scpB)携带率68.24%(167/170)、C蛋白apha亚基(bca)携带率100%(170/170)、C蛋白beta亚基(bac)携带率94.71%(161/170)、调节蛋白(dltR)携带率100%(170/170)、CAMP因子(cfb)携带率60.59%(103/170)、超氧化物歧化酶(sodA)携带率98.82%(168/170)。170株菌携带毒力基因形成10个谱系，其中dltR-bca-sodA-spb1-cfb-bac(38.24%， 65/170)，dltr-bca-sodA-spb1-bac(23.53%，40/170)和dltr-bca-sodA-spb1-cfb-bac-scpB(22,35%，38/170)为主要的谱系，dltr-bca-sodA-spb1-bac-scpb(8.24%，14/170)和dltr-bca-sodA-spb1(4.71%， 8/170)次之。

表2 无乳链球菌多位点序列型扩增引物及扩增片段大小

F：正向引物；R：反向引物；SF:正向测序引物；SR:反向测序引物

2.2 MLST分型

获得的序列结果经过Seqman软件分析，参照MLST标准长度截取DNA序列，进行等位基因比对(http:∥pubmlst.org)。等位基因比对完成后，再将各位点数值依次输入网站对应基因座位号码，进行MLST序列的判定。目前对170株无乳链球菌MLST分型基本完成，结果表明adhP, pheS, atr, glnA, sdhA, glcK, tkt 7个位点均可以成功扩增出目的基因条带。经过目的基因测序、分析、网上比对表明所有170株菌在7个位点均为单一的等位基因，为adhP(10), pheS(1), atr(2), glnA(1), sdhA(3), glcK(2), tkt(2)，序列型为ST7型。

2.3 脉冲场凝胶电泳分型

对无乳链球菌共计146株进行PFGE分析，结果表明无乳链球菌基因组经SmaI酶切后产生7～11个片段(图1)。经聚类分析后，146株菌分为6个簇(A-D，F，G)，相似性介于86%～100%之间。A(18)，B(16)，C(103)，D(7)为主要的遗传簇，占菌株数的98.63%(144/146)。基因簇A，C在4个采样区均有发现；基因簇B分布在吴川、茂名和阳江；基因簇D分布在茂名、珠海和阳江；基因簇F和G分别来自茂名和珠海。在A-D遗传簇中均有发现来自不同地区的菌株呈现100%的相似性，为同一进化的克隆菌株(图1)。

图1 无乳链球菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)部分结果(SmaI)。146株菌聚类分为6个遗传簇(A-D，F，G)，A-D为广东地区的主要遗传簇Fig.1 The results of PFGE with SmaI. One hundred and forty-six isolates were assigned to six clusters (A-D, F,G). Clusters A to D were the predominant clusters in Guangdong

3 讨 论

在前期对广东省5个罗非鱼主要养殖区内的罗非鱼病原进行采样、分离鉴定的基础上，本研究首先通过PCR的方法检测分离菌株携带毒力基因的情况，发现170株无乳链球菌中，毒力基因的携带率介于60.59%～100%之间，形成的10个谱系中前3个谱系占84.12%。cfb基因的携带率为60.59%，它是B群链球菌特有基因，编码CAMP因子或溶血促进因子，能与金黄色葡萄球菌分泌的B溶血毒素共同作用，促进绵羊红细胞的溶血及胞膜成分的溶解，也是一种强毒力因子，在细菌入侵宿主细胞与抗吞噬作用等方面起重要作用。其它毒力基因多参与菌体抵御宿主细胞免疫因子攻击、参与细胞粘附等功能，高毒力基因携带率也提示这些菌株可能具有较强的致病力[16]。

文献资料显示无乳链球菌分子分型研究目前常用方法有多位点序列分型(MLST)[14]、多位点可变数目串联重复序列分析( MLVA)[17]，以及脉冲场凝胶电泳(PFGE)[15]。研究中，我们应用多位点序列分型及脉冲场凝胶电泳对前期分离的170无乳链球菌进行分子分型研究，以探讨广东地区罗非鱼成鱼中携带的无乳链球菌的主要型别及分布特征。多位点序列型的结果显示所有菌株在7个位点均为adhP(10)，pheS(1)，atr(2)，glnA(1)，sdhA(3)，glcK(2)，tkt(2)，所属的序列型为ST7型，已有的资料表明，ST7型为高致病ST型，可引起人、牲畜、鱼类的感染，因而本次分离的菌株可能均为高致病菌株，与毒力基因高携带率相一致。

PFGE的结果显示146株菌分属于6个遗传簇，其中C型为主要的基因簇，其次为A，B，D型。FPGE分型不具有地域特异性，同时我们发现在不同地域中，可流行相同的克隆菌株(同源性100%)，这一结果与前期其它学者的研究结果相一致[15]，提示广东地区罗非鱼中流行的无乳链球菌高度一致，可能经历过一次群体的纯化过程。研究中，我们应用PFGE作为分子分型研究方法，而并没有使用MLVA，是因为PFGE的结果可重复性高，在不同的实验室间可以做横向对比分析。本次研究结果与其它研究者的研究结果对比分析发现相同的分型中，电泳带型一致性接近100%。但有研究者报道，MLVA比脉冲场电泳( PFGE) 和多位点序列分型( MLST) 区分度更高，并且方便、经济[18]。但我们认为，MLVA的研究方案并不成熟，不同的操作者间难以标准化，同时提取的DNA质量、操作者技术水平，对MLVA结果判读的准确性等因素都将影响MLVA的结果，而PFGE、MLST已经建立了标准的操作流程，结果可比性高，更具有现实应用价值。

Radtke等[17]通过MLVA 对无乳链球菌进行分型，研究表明11个位点中有5个位点的变异度最大，进而选取这5个位点建立MLVA的方法。随后郭玉娟等[11]选用这5个位点进行PCR扩增，PCR产物凝胶电泳和部分目的片段测序结果表明所有鱼源无乳链球菌均为同一型，而来源于人及牛的菌株带型则有较大差异。与此相似，Pereira 等[19]用PFGE 分析也发现鱼源、人源和牛源无乳链球菌在基因型上均不相关。虽然牛源和鱼源的无乳链球菌分子血清型均为Ⅰa 型，但是它们的表面蛋白抗原基因不同，这表明鱼源和牛源无乳链球菌在表面蛋白抗原上存在明显的差异性。虽然本研究中，我们没有纳入人源和牛源的无乳链球菌作为研究的对照，依据已有的研究[20]，我们可以推测，鱼源、人及牛源的无乳链球菌可能具有共同的序列型别，但他们的PFGE型别可能存在较大的差异，因此他们可能存在宿主的选择性，也即是表面抗原可能有所不同，但是，我们依然无法确定他们之间的传播关系。进一步的研究中，我们将开展这类研究并探讨广东地区感染罗非鱼的无乳链球菌的可能来源，以期为罗非鱼链球菌病害防控奠定基础。

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Molecular epidemiology ofStreptococcusagalactiaein tilapia in Guangdong

FANGWei1,LIANGYuheng2,NINGDan3,KEBixia2,KEChangwen2,DENGXiaoling2,PENGHualin1,SUNJiufeng3,WANGXinyun1

(1．Guangdong Provincial Center for Aquatic Animal Disease Prevention and Control，Guangzhou 510222, China；2. Guangdong Provincial Center for Disease Prevention and Control, Guangzhou 511430, China；3. Guangdong Provincial Institute of Public Health, Guangdong Provincial Center for Disease Prevention and Control，Guangzhou 511430, China)

Tilapia samples were collected from five main tilapia farms in Guangdong. The characteristics of the isolates were determined by virulence gene detection, Multilocus Sequencing Type (MLST), and Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE). The frequency of virulence gene in all isolates varied from 60.59% to 100%. Ten distribution patterns of virulence gene were identified, dltR-bca-sodA-spb1-cfb-bac (38.24%,65/170), dltr-bca-sodA-spb1-bac (23.53%，40/170), and dltr-bca-sodA-spb1-cfb-bac-scpB (22,35%,38/170) were the predominant patterns, followed by dltr-bca-sodA-spb1-bac-scpb (8.24%, 14/170) and dltr-bca-sodA-spb1 (4.71%, 8/170). The single allele was observed in each of seven loci, adhP(10), pheS(1), atr(2), glnA(1), sdhA(3), glcK(2), tkt(2)and result in unique ST 7 (Sequencing Type 7). One hundred and forty-six isolates were assigned to six clusters based on the PFGE results. The similarity between these clusters ranged from 86% to 100%. Cluster A (18), B (16), C (103) and D (7) were the predominant clusters, account for 98.63% of all isolates. Cluster A and C were distributed in all four areas, Cluster B were mainly isolated from Wuchuan, Maoming and Yangjiang, whereas Cluster D were isolated from Maoming, Zhuhai and Yangjiang. The unique clusters F and G were isolated from Maoming and Zhuhai, respectively. In addition, the clones in Clusters A--D isolated from different areas in Guangdong showed 100% similarity. High proportion of strains with virulence gene was observed inStreptococcusagalactiaestrains isolated from tilapia farm in Guandong. All of isolates belonged to the unique ST7. The clones with 100% similarity were identified in different area suggesting the cross infection and transmission in Guangdong, China.

tilapia;Streptococcusagalactiae; virulence gene; MLST; PFGE

10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.02.018

2015-08-31

广东省鱼病专项基金资助项目(粤财农〔2014〕89号)

方伟(1982年生)，男；研究方向：水产养殖及养殖病害防治；通讯作者：王云新,孙九峰；E-mail:wfangshuichan@126.com,sunjiuf@163.com

Q78

A

0529-6579(2016)02-0097-06