TLR4受体拮抗剂对Aβ1-42诱导的小胶质细胞炎性因子分泌的影响

赵　超, 宋书莲, 周　洁, 金国良, 2, 周　妍, 2,韩晶晶, 2, 花　放, 2, 3

( 1. 徐州医学院附属医院 神经科, 江苏 徐州, 221006;2. 徐州医学院神经系统疾病研究所, 江苏 徐州, 221002;3. 江苏省麻醉学重点实验室, 江苏 徐州, 221002)



TLR4受体拮抗剂对Aβ1-42诱导的小胶质细胞炎性因子分泌的影响

赵超1, 宋书莲1, 周洁1, 金国良1, 2, 周妍1, 2,韩晶晶1, 2, 花放1, 2, 3

( 1. 徐州医学院附属医院 神经科, 江苏 徐州, 221006;2. 徐州医学院神经系统疾病研究所, 江苏 徐州, 221002;3. 江苏省麻醉学重点实验室, 江苏 徐州, 221002)

摘要:目的探讨体外培养条件下Toll样受体4(TLR4)拮抗剂对β淀粉样蛋白1-42片段(Aβ1-42)诱导的小胶质细胞炎性因子分泌的影响。方法用不同浓度的Aβ1-42(终浓度为0、1、5、10、20、40、80 μmol/L)及TAK-242(终浓度1 μmol/L)处理小鼠小胶质细胞(BV2)，24 h后取其上清干预小鼠海马神经元(HT22)。48 h后，应用CCK8方法检测HT22细胞的存活，ELISA方法检测BV2细胞上清液中TNF-α、IL-1β水平。结果与空白对照组相比，Aβ1-42直接作用于体外培养的小胶质细胞后，以剂量依赖的方式诱导TNF-α、IL-1分泌的增加(P<0.05)；与空白对照组相比，Aβ1-42诱导组培养液干预的HT22细胞存活率显著下降(P<0.05)。给予TLR4拮抗剂TAK-242干预后，Aβ1-42诱导TNF-α、IL-1分泌的作用被抑制，细胞分泌TNF-α、IL-1β水平较Aβ1-42诱导组显著降低(P<0.05)，HT22细胞存活率也显著提高(P<0.05)。结论阻断TLR4可抑制Aβ1-42诱导的小胶质细胞炎性因子的分泌，并减轻活化的小胶质细胞对海马神经元的损害。

关键词:Aβ1-42; TLR4拮抗剂; 小胶质细胞; 海马神经元

阿尔茨海默病(AD)又称早老性痴呆，是以进行性记忆减退、认知障碍、人格改变等为主要特征的一种慢性进行性神经变性疾病。关于AD的发病机制，目前认为与β淀粉样蛋白(Aβ)沉淀诱发小胶质细胞(MG)的活化引起的脑内慢性炎症反应有关[1]。活化的小胶质细胞既可以吞噬和清除老年斑(SP)，从而保护神经元，又可以促进炎性因子的释放，加重神经元的损伤、功能障碍甚至凋亡[2]。既往的研究[3]显示，Toll样受体(TLRs)参与免疫炎症反应的调节，在免疫炎症反应的诱导和调节中起着重要作用。TLR4在介导小胶质细胞的活化和炎性因子的合成与释放中起重要作用[4]。有研究[5]显示TLR4参与了AD的病理生理过程，TLR4基因敲除小鼠纤维素型Aβ的沉积较野生型小鼠增加，TLR4参与Aβ的摄取和清除[6]。然而, TLR4在AD脑组织内的小胶质细胞活化及炎症反应中的作用尚不清楚。本文应用Aβ1-42体外诱导小胶质细胞(BV2)活化，研究TLR4特异性拮抗剂TAK-242对Aβ1-42诱导的小胶质细胞炎性因子的表达及其对海马神经元损伤的影响，现报告如下。

1材料与方法

1.1实验材料

小鼠小胶质细胞株(BV2细胞)及小鼠海马神经细胞株(HT22细胞)为美国东田纳西州立大学医学院赠予。DMEM高糖培养基、DMEM/F12培养基均购于HyClone公司[赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司，货号SH30022.01B、SH30023.01B]、胎牛血清购于Gibco公司(北京智杰方远科技有限公司，货号16000-044)；Aβ1-42购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司(货号A118755)，使用前置于37℃水浴箱孵育1周成聚集态。小鼠ELISA TNF-α、IL-1β试剂盒均购于eBioscience公司(San Diego，CA，USA，货号88-7324、88-7013)；CCK8试剂盒购于东仁化学科技(上海)有限公司(货号CK04)；酶标仪购于BioTek Instruments，Inc(美国伯腾仪器有限公司北京代表处，型号ELx800)；TLR4-MyD88特异性抑制剂CLI-095购于InvivoGen公司(San Diego，CA92121-USA，货号tlrl-cli95)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养: BV2细胞的体外培养：细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，每1～2 d更换培养液，待细胞长至80%左右时，按1∶4传代。

HT22细胞的体外培养: 细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，每2 d更换培养液，待细胞长至80%左右时，按1∶2传代。

1.2.2BV2细胞处理: 将BV2细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板内，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养, 24 h后镜下观察细胞长至70%左右，加入Aβ1-42，终浓度分别为0、1、5、10、20、40、80 μmol/L，培养箱中培养24 h, 收集细胞培养上清液, -20 ℃保存待用。ELISA方法检测不同浓度组上清液中TNF-α含量。

1.2.3神经元HT22的干预: HT22细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板内培养，进行细胞毒性试验。HT22用无血清培养基饥饿4 h后用DMEM/F12培养基及BV2培养的上清液混合培养48 h。用细胞增殖检测方法CCK8法检测细胞存活率，以Aβ1-42处理组与未处理组吸光度值的百分比表示。

1.3实验分组

本实验第一部分应用不同浓度Aβ1-42(终浓度为0、1、5、10、20、40、80 μmol/L)处理小胶质细胞(BV2细胞)，24 h后检测上清炎症因子TNF-α的含量，以及用该上清处理的海马神经元(HT22细胞)的存活率，选择Aβ1-42处理BV2细胞最适宜浓度。

实验第二部分将BV2细胞分为4组，即空白对照组(培养基组，用DMEM高糖培养基培养24 h)，TAK-242处理组(TAK-242，用1 μmol/L TAK-242培养24 h)，Aβ1-42诱导组(Aβ1-42，选择40 μmol/L作为最适宜浓度处理BV2细胞)和Aβ1-42联合TAK-242组(TAK-242 + Aβ1-42，用1 μmol/LTAK-242处理BV2细胞1 h后，加终浓度为40 μmol/L的Aβ1-42)。

1.4检测方法

1.4.1CCK8法检测细胞存活率: BV2细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板内，于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养，24 h后镜下观察细胞长至70%左右，按上述分组处理24 h后，1 000 g、20 min离心收集细胞培养上清。HT22用无血清培养基饥饿4 h后用DMEM/F12培养基及BV2使用过一次的上清液混合培养48 h，每孔中加入100 μL不含血清培养基+10 μL CCK8，于37℃、5% CO2条件下继续孵育1 h。ELx800型酶标仪于450 nm波长处测定吸光度值，细胞生存率以(实验组-调零组)与(对照组-调零组)吸光度值的百分比表示。

1.4.2ELISA法检测细胞培养上清中TNF-α、IL-1β含量: 按上述实验分组处理24 h后，收集细胞培养上清，按照ELISA试剂盒说明书，按每孔100 μL分别将标准品、样品稀释液加入对应孔中，显色后以96孔酶标仪于450 nm处测OD值(光密度)，建立标准曲线，依据标准曲线计算出各组上清液中TNF-α、IL-1β含量，每一个样品设置3个复孔。

1.5统计学处理

应用GraphPad Prism5软件进行数据分析处理，实验结果以P表示，采用单因素方差分析数据，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同浓度的Aβ1-42对BV2细胞释放的TNF-α的影响

Aβ1-42处理的BV2细胞的上清中可检测到TNF-α。Aβ1-42浓度(5、10、20、40、80 μmol/L)处理的实验组与对照组比较有显著差异(P<0.05)。此外，TNF-α水平的增加与Aβ1-42(1、5、10、20、40、80 μmol/L)呈浓度依赖性关系。见图1、2。

2.2不同浓度Aβ1-42对HT22细胞的毒性作用

为了评估Aβ1-42对HT22的损伤作用，用不同浓度的Aβ1-42处理BV2细胞24 h，取其上清液处理HT22细胞48 h。CCK8结果显示，低浓度Aβ1-42(1、5、10 μmol/L)作用时未显著影响HT22存活率。随着Aβ1-42浓度的升高(20、40、80 μmol/L)，HT22存活率与对照组相比显著降低(P<0.05)。HT22细胞存活率随着Aβ1-42浓度的升高而逐渐降低，存在着量效关系。 Aβ1-42达到对HT22细胞的半数抑制率(IC50)的浓度约为40 μmol/L。见图3。

图1 Aβ1-42处理24h后BV2上清中TNF-α含量的标准曲线

图2 Aβ1-42处理24h后BV2上清中TNF-α含量的变化(n=6,与对照组比较,#P<0.05)

与对照组比较,#P<0.05;与40μmol/L的Aβ1-42组比较,*P<0.05图3 不同浓度Aβ1-42处理BV224h后上清对HT22细胞活力的影响(n=6)

2.3TLR4拮抗剂TAK-242对Aβ1-42诱导的小

胶质细胞TNF-α、IL-1β释放的影响与对照组相比，TAK-242单独处理未影响TNF-α和IL-1β和表达(P>0.05)，而Aβ1-42显著增加TNF-α和IL-1β的释放(P<0.001)。TLR4拮抗剂TAK-242可以抑制Aβ1-42诱导的TNF-α和IL-1β的释放。见图4、5、6。

图4 Aβ1-42处理24h后BV2上清中TNF-α含量的标准曲线

图5 Aβ1-42处理24h后小胶质细胞上清中TNF-α的表达(n=6,与对照组比较,#P<0.05)

图6 Aβ1-42处理24h后小胶质细胞上清中IL-1β的表达(n=6,与对照组比较,#P<0.05)

2.4TLR4拮抗剂对Aβ1-42诱导的小胶质细胞释放产物对神经元存活的影响

实验结果显示，Aβ1-42处理的BV2细胞的上清液可以显著减低HT22细胞的存活率(与对照组比较,P<0.05)；TAK-242处理BV2可以减少Aβ1-42诱导的HT22细胞死亡，HT22细胞的存活率在Aβ1-42组与Aβ1-42+TAK-242组之间有显著性差异(P<0.05)。见图7。

与对照组比较,#P<0.05;与Aβ比较,*P<0.05;与TAK-242比较,@P<0.05图7 TAK-242对Aβ1-42诱导HT22细胞存活率的影响(n=6)

3讨论

阿尔茨海默病是一种与智力相关的神经系统变性疾病，以进行性记忆减退、认知障碍、人格改变等为主要特征。其发病机制尚不明确，尚无有效的治疗方法，目前已被公认的致病机制为神经元纤维tau蛋白的缠结和与年龄相关的β-淀粉样蛋白的沉积[7-8]，这两方面均导致了慢性炎性反应，从而引起神经系统退行性改变。小胶质细胞是中枢神经系统固有免疫系统的主要组成部分，在AD患者中，小胶质细胞被Aβ激活成反应性细胞[9]。活化的小胶质细胞一方面通过TLR4的表达上调，导致下游炎性因子的释放量增加，加重神经元的损伤、功能障碍甚至凋亡；另一方面，释放一些促进神经修复和具有神经保护作用的营养因子[10]。有研究[11]发现，小胶质细胞BV2在Aβ25-35刺激后，TLR4蛋白和RNA表达水平均有所上调。阿尔兹海默病模型小鼠TLR4相关的TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-17的表达均显著上调[12]。由此可见，TLR4信号转导通路可能通过上调炎性因子的表达参与AD的发生发展过程，因此抑制小胶质细胞的炎症反应对抑制AD的病理过程非常重要。

以往的研究[13]发现Toll样受体在免疫炎性反应中起着关键性的作用，其中TLR4与其配体结合，激活下游调节蛋白TRIF和MyD88调节的信号通路，TLR4可以在相应条件下选择性激活不同的信号通路。当MyD88信号通路激活时，转录核因子NF-kB和/或激活蛋白1(AP-1)被激活[14]，促使TNF-α、IL-6、IL-1等炎症因子和协同刺激分子的大量表达[15]。而TRIF依赖性信号通路最终可活化干扰素调节因子3，使得IFN-β、IL-10、TGF-β等抗炎因子合成增加[16-17]。

TAK-242是一种外源性小分子TLR4信号通路特异性抑制剂[18]，通过选择性地抑制TLR4胞内信号通路，抑制NO等炎性因子的产生，明显缓解LPS引起的低血压，从而缓解内毒素血症的临床症状，提高存活率[19]。其可完全性地阻断LPS通过MAPK和NF-kB信号通路所引起的炎性反应，其阻断作用部分来源于MAPKs通路[20]。在体实验结果[21]表明，TAK-242可通过血脑屏障，阻断TLR4信号通路，抑制下游蛋白磷酸化，下调sTNF RII、MCP-1等炎性因子的表达，改善脑神经功能，改善小鼠脑缺血/再灌注损伤。但是TLR4抑制剂是否能抑制Aβ1-42激活的小胶质细胞活化及炎症因子的释放，改善其导致的神经细胞死亡尚无研究结论。

本实验用不同浓度的Aβ1-42刺激小胶质细胞，发现Aβ1-42激活小胶质细胞释放TNF-α、IL-1β等炎性因子，且Aβ1-42与BV2分泌的TNF-α、IL-1β有剂量相关性。此外，由Aβ1-42处理的小胶质细胞的上清液可导致海马神经元的死亡，且与Aβ1-42的浓度相关。Aβ1-42达到对HT22细胞的半数抑制率(IC50)的浓度约为40 μmol/L。该实验结果显示，Aβ1-42可以激化小胶质细胞促进其炎症因子的释放。Aβ1-42诱导的小胶质细胞释放产物可以导致海马神经元的死亡。

LPS可以激活小胶质细胞，引起TLR4超表达和下游炎性因子NO、前列腺素2(PGE2)[22]。有研究[23]表明，Aβ25-35可以激活小胶质细胞，并上调TLR4蛋白的表达，肿瘤坏死因子(NF-κB)转录活性增强。本实验应用TLR4拮抗剂TAK-242阻断TLR4通路可以显著抑制Aβ1-42诱导的小胶质细胞炎症因子的释放并减轻其导致的海马神经元的死亡。该结果表明，Aβ1-42诱导的小胶质细胞炎症因子的释放是通过TLR4介导的信号通路调节的，阻断TLR4信号通路抑制炎性因子的释放减轻神经元死亡，TLR4介导的信号通路可能是研究AD的发病机制和干预措施的新的靶点。

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Effect of TLR4 antagonist on the secretion of inflammatory cytokines in microglia induced by Aβ1-42

ZHAO Chao1, SONG Shulian1, ZHOU Jie1, JING Guoliang1, 2,ZHOU Yan1, 2, HAN Jingjing1, 2, HUA Fang1, 2, 3

(1.DepartmentofNeurology,TheAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu, 221006；2.InstituteofNervousSystemDisease,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu, 221002；3.KeyLaboratoryofAnesthesiologyofJiangsuProvince,Xuzhou,Jiangsu, 221002)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effect of Toll-like receptor 4 (TLR4) antagonist on the secretion of inflammatory cytokines in microglia induced by Amyloid β protein 1-42 (Aβ1-42). MethodsCultured microglia cells (BV2) were stimulated with different concentrations of Aβ1-42 (final concentrations of 0, 1, 5, 10, 20, 40 and 80 μmol/L) and TLR4 antagonist (TAK-242, 1 μmol/L) for 24 h, respectively. The supernatants were used to treat cultured hippocampus neurons (HT22) for 48 h. The viability of HT22 cells was tested by CCK8 kit, and levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin l-β (IL-1β) in the culture medium were detected by method of ELISA. ResultsCompared with control group, treatment of Aβ1-42 significantly increased the levels of TNF-α and IL-1β in cultured microglia cells in a dose-dependent manner (P<0.05). In addition, Aβ1-42 treated supernatants induced a significant decrease of viability in cultured HT22 cells compared with non supernatant treated control (P<0.05). Compared with non-TAK-242 treated group, TAK-242 significantly inhibited the increase of TNF-α and IL-1β in cultured microglia cells (P<0.05), and attenuated the neuronal death induced by the supernatants from cultured microglia treated by Aβ1-42 (P<0.05). ConclusionBlocking TLR4 by antagonist can inhibit the release of cytokines from microglia induced by Aβ1-42, and attenuate the damage of neurons induced by supernatants from cultured microglia treated with Aβ1-42.

KEYWORDS:Aβ1-42; TLR4 antagonist; microglia; hippocampal neurons

中图分类号:R 745.1

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)09-001-05

DOI:10.7619/jcmp.201609001

通信作者:花放, 男, 江苏特聘教授、医学博士、博士生导师, E-mail: huafang@xzmc.edu.cn

基金项目:国家自然科学基金面上项目(81271268); 国家自然科学基金面上项目(81571469); 2012年江苏特聘教授项目;

收稿日期:2015-12-16

江苏省2014年双创团队项目。