去甲斑蝥酸钠对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

徐晓莉　王　钦　罗　佳

(南通大学附属医院药学部，江苏　南通　226001)



去甲斑蝥酸钠对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

徐晓莉王钦罗佳

(南通大学附属医院药学部，江苏南通226001)

〔摘要〕目的观察去甲斑蝥酸钠对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响，探讨其抗胃癌的作用机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定不同浓度去甲斑蝥酸钠对人胃癌SGC-7901细胞生长的抑制率，其中实验组的去甲斑蝥酸钠浓度分别为0.4、1.0、2.5、6.0 mg/L，对照组不加去甲斑蝥酸钠。采用流式细胞仪检测SGC-7901细胞的增殖周期，并计算细胞增殖指数。结果浓度0.4、1.0、2.5、6.0 mg/L去甲斑蝥酸钠的实验组的OD值均低于对照组(t=2.871、5.295、10.100、13.836，P均<0.05)。随着去甲斑蝥酸钠浓度的提高，对SGC-7901细胞的抑制率随之增大。经过流式细胞仪的检测，与对照组相比，实验组的G0/G1期细胞比例显著增高(P<0.05)，而S期细胞比例和细胞增殖指数明显降低(P<0.05)，均呈现出时间、浓度依赖性。结论去甲斑蝥酸钠在体外可抑制人胃癌SGC-7901细胞的增殖，体现出抗癌活性，在胃癌治疗方面具有广阔的应用前景。

〔关键词〕去甲斑蝥酸钠；人胃癌SGC-7901细胞；抑制率；细胞增殖指数

寻找提高化疗药物对胃癌的疗效，进一步降低毒副反应受到许多研究者的重视，而从中草药中发现的一些抗肿瘤活性物质已成为研究热点。斑蝥素是从中药斑蝥中提取出的抗肿瘤活性成分，对肝癌、胃癌、白血病等恶性肿瘤具有较好的疗效，应用后无骨髓抑制不良反应，求有升高白细胞的优点，其细胞毒机制与抑制肿瘤细胞的蛋白磷酸酶有关〔1,2〕。去甲斑蝥酸钠是斑蝥素的半合成衍生物，可用作中晚期肝癌的临床治疗，并可增强机体的免疫力，升高白细胞水平〔3～5〕。与斑蝥素比较，去甲斑蝥酸钠的刺激性和毒性进一步减少，并能显著降低泌尿道不良反应发生率。本文观察去甲斑蝥酸钠对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响，探讨其抗胃癌的作用机制。

1材料和方法

1.1细胞人胃癌SGC-7901细胞株，由苏州大学医学部药学院提供，用含10% 小牛血清RPMI1640细胞培养液在37 ℃、5%CO2条件下培养，24 h后取对数生长期细胞用0.25 %胰蛋白酶消化并接种传代继续培养。

1.2试剂与仪器去甲斑蝥酸钠(北京万辉药业集团公司)；RPMI-1640培养基、小牛血清均购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Amresco公司。Forma Steri-Cult 型红外CO2恒温培养箱(美国Thermo公司)；DNM-9606型酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司)；IX83型倒置显微镜(日本奥林巴斯株式会社)；BD FACS Calibur型全自动多色分析流式细胞仪系统(美国Becton Dickinson公司)。

1.3药物对细胞生长的抑制试验采用MTT法测定药物对细胞生长的抑制率。将对数生长期人胃癌SGC-7901细胞株用培养基稀释后置96孔细胞培养板内，每孔的细胞浓度为1.0×104个/ml，置5%CO2恒温培养箱中37℃培养24 h。吸去每个孔内的培养液，并加入用培养基稀释为浓度0、0.4、1.0、2.5、6.0 mg/L去甲斑蝥酸钠200 μl，每个浓度均设置8个平行孔，并设置6个平行空白对照孔。置5%CO2恒温培养箱中37℃继续培养42 h，每孔中均加入浓度为5 mg/ml的MTT溶液20 μl，37℃继续培养6 h后停止培养，吸去每孔的培养液，均加入150 μl二甲亚砜，将96孔板置于震荡器中持续震荡15 min使每孔成均匀的细胞混悬液。将96孔板置酶标仪中在492 nm波长处测试每孔的光吸收值(OD值)。抑制率(%)=(1-加药孔OD值/阴性对照孔OD值)×100%。

1.4细胞周期检测分别培养24 h、48 h、72 h后，收集药物作用后的各组细胞各1×106个，置离心机中1 500 r/min速度离心5 min，仅保留沉淀，采用PBS溶液洗涤沉淀3次，再加入温度为4℃的70%乙醇溶液固定，置4℃冰箱中12 h。然后1 500 r/min速度离心5 min并弃去乙醇溶液，用PBS溶液洗涤混悬细胞，再采用直径为400目筛网过滤，滤液离心后仅保留沉淀；加入RNaseA使浓度为60 μg/ml，充分摇匀后保持37℃孵育30 min，再加入碘化丙啶使成终浓度50 μg/ml，保持4℃避光处理30 min。采用流式细胞仪检测细胞的增殖周期，并按照公式计算细胞增殖指数(PI)=S+G2/M细胞数/细胞总数×100%。

1.5统计学方法应用SPSS22.0统计学软件行t检验及单因素方差分析。

2结果

2.1去甲斑蝥酸钠对SGC-7901细胞的抑制率浓度0.4、1.0、2.5、6.0 mg/L去甲斑蝥酸钠的实验组的OD值(0.54±0.10，0.40±0.12，0.24±0.09，0.15±0.07)均低于对照组(0.67±0.08，t=2.871、5.295、10.100、13.836，P均<0.05)。随着去甲斑蝥酸钠浓度的提高，对SGC-7901细胞的抑制率随之增大(0.4、1.0、2.5、6.0 mg/L去甲斑蝥酸钠组分别为(19.40±5.73)%、(40.30±8.56)%、(64.18±9.10)%、(77.61±9.98)%。

2.2SGC-7901细胞的细胞周期和PI经过流式细胞仪的检测，与对照组相比，实验组的G0/G1期细胞比例显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)，而S期细胞比例和PI明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，均呈现出时间、浓度依赖性。SGC-7901细胞的G0/G1、S期细胞比例和PI见表1。

表1　SGC-7901细胞的G0/G1、S期细胞比例和

与对照组比较：1)P<0.05；与同浓度组前一时间点比较：2)P<0.05；与同时间点前一浓度组比较：3)P<0.05

3讨论

斑蝥是昆虫纲鞘翅目芫菁科南方大斑蝥与黄黑小斑蝥的干燥虫体，是传统昆虫类中药，有剧毒，其主要有效成分为斑蝥素。近年来的研究通过人工改造化学结构的方法，合成了一些斑蝥素的衍生物，主要有：去甲斑蝥素、甲基斑蝥胺、斑蝥酸钠、羟基斑蝥胺等〔6,7〕。以上衍生物与斑蝥素相比，毒性显著下降，且均具有抗肿瘤活性〔8～11〕。去甲斑蝥素和氢氧化钠共热后的水解产物去甲斑蝥酸钠，同样保留了斑蝥素的抗肿瘤药理作用，且毒副反应低于斑蝥素。

本结果发现不同浓度的去甲斑蝥酸钠作用48 h后，SGC-7901细胞的生长出现不同程度的抑制作用，且随去甲斑蝥酸钠浓度的提高，对SGC-7901细胞的抑制率随之增大，表明去甲斑蝥酸钠对人胃癌SGC-7901细胞具有明确的细胞毒作用，体现出显著的体外抗癌活性，且这种细胞毒作用具有浓度依赖性。

胃恶性肿瘤细胞的增殖周期可分为G1/G0期、S期、G2期和M期。其中，S期是SGC-7901细胞的DNA合成期，在细胞的恶性增殖过程中发挥主要作用，因而恶性肿瘤细胞的S期比例越高，其增殖越快，肿瘤细胞的倍增时间越短〔12〕。恶性肿瘤细胞的增殖活性通常用PI表示，其数值越大表明肿瘤细胞增殖越旺盛〔13〕。本文结果表明去甲斑蝥酸钠在体外可将SGC-7901细胞有效停滞在G1/G0期，进入S期的肿瘤细胞比例明显减少，从而抑制SGC-7901细胞的增殖，在细胞周期的角度解释了去甲斑蝥酸钠的体外抗胃癌活性。

早期胃癌患者多为老年人群，往往并未表现出典型的临床表现，当出现典型表现时患者大多已丧失给予传统化学治疗的时机〔14〕。胃癌的发生和进展与肿瘤细胞的过度增殖和凋亡减缓密切相关，当胃癌细胞的凋亡与增殖过程失去平衡后，胃癌将会迅速进展和扩散〔15〕。因此，选择合适的抗胃癌药物，必须从抑制胃癌细胞增殖和促进胃癌细胞的凋亡方面着手。去甲斑蝥酸钠作为一种中药有效成分的半合成衍生物，可抑制人胃癌SGC-7901细胞的增殖，体现其在胃癌治疗方面具有广阔的应用前景。

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〔2014-12-03修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

第一作者：徐晓莉(1970-)，女，主管药师，主要从事医院药学研究。

〔中图分类号〕R735.2

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)09-2074-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.011