何首乌对血管性认知障碍大鼠学习记忆功能的影响

王洲羿，夏光明，周　刚，肖展翅，黄虎翔，陈浩特，李　钢

湖北省黄冈市中心医院(湖北黄冈 438000)



何首乌对血管性认知障碍大鼠学习记忆功能的影响

王洲羿，夏光明，周刚，肖展翅，黄虎翔，陈浩特，李钢

湖北省黄冈市中心医院(湖北黄冈 438000)

摘要：目的探讨何首乌对血管性认知障碍(VCI)大鼠学习记忆功能的影响。方法筛选造模成功VCI大鼠48只，随机分为4组：何首乌高剂量组、何首乌中剂量组、何首乌低剂量组、VCI模型组，每组12只大鼠。另有12只假手术大鼠作为正常对照组(假手术组)。造模成功后对大鼠用灌胃器灌胃，灌胃液体温度为20 ℃，何首乌高、中、低剂量组给予4.0 g/mL、2.0 g/mL、0.5 g/mL何首乌溶液灌胃，模型组、假手术组均生理盐水灌胃，灌胃剂量按1 mL/(100 g·d)，共28 d。术后28 d各组大鼠开始行Morris水迷宫学习记忆能力等行为学测试，行为学测试结束后，行免疫组织化学检测Bcl-2、Bax阳性细胞的表达。结果与VCI模型组相比，何首乌中剂量组、何首乌高剂量组大鼠逃避潜伏期明显缩短，穿越目标象限时间明显延长，穿越平台次数明显增加，差异有统计学意义(P<0.05 或P<0.01)；各组VCI大鼠造模28 d完成行为学试验后海马区Bcl-2和Bax蛋白表达显著高于假手术组。而何首乌高剂量组、中剂量组与VCI模型组相比Bcl-2蛋白表达增加的幅度明显大于Bax蛋白(P<0.05或P<0.01)。结论何首乌通过调节Bcl-2、Bax蛋白表达来抑制细胞凋亡，从而改善VCI大鼠的学习以及认知能力。

关键词：血管性认知障碍；何首乌；学习记忆功能；Bcl-2；Bax；呆病

血管性认知障碍(VCI)是伴随着脑血管病的发生出现的一种记忆、认知和行为等障碍的综合征，其中较为严重的又称血管性痴呆(VD)。随着我国老龄人口的不断增多，血管性痴呆这一问题日益突出。与阿尔茨海默病(AD)等其他认知功能障碍疾病不同，VCI是一种可预防、可延缓认知损害进程，甚至可逆转的综合征[1]。这提示人们应该把重点放在对VCI的长期诊治和预防干预上来。因此，在充分认识VCI的基础上。在VCI初期发展到VD之前，就做到早期预防、早期诊断、早期治疗，阻止病情发展，无疑对预防和控制VD的发生和发展有着重要的现实意义。因此开发研究确实有效的预防治疗药物非常迫切。何首乌(Polygonum Multiflorum Thunb)是祖国医学中抗衰老之中药，据《本草纲目》记载何首乌有“益精髓、延年不老”之效。本研究拟建立VCI大鼠模型，通过何首乌对模型大鼠的治疗，从其行为学和分子生物学水平分析血管性认知障碍大鼠发病机制。

1材料与方法

1.1实验动物SD大鼠80只，SPF级，体重(200±20)g，雌雄各半，湖北省黄冈市中心医院实验动物中心提供。大鼠购买后，养殖于自然光线下，保持温度20 ℃～25 ℃，自由进食进水，适应性饲养1周。

1.2受试药物何首乌药材由本课题组所在单位药剂科提供，原药材经该单位质检部鉴定为蓼科植物何首乌的块根，其质量符合《中国药典》2010版何首乌项下规定。制首乌饮片由本实验室人员自行炮制并检测，其质量符合《中国药典》2010版制何首乌项下规定。受试药物提取制备：取制首乌饮片粗粉，先用80%乙醇热提取两次，提取液用旋转蒸发仪浓缩，除去乙醇后加水配制成相当于制何首乌4.0 g/mL、2.0 g/mL、0.5 g/mL 3种高、中、低剂量浓度的溶液。

1.3仪器与试剂MT-200Morris水迷宫视频跟踪分析系统，成都泰盟科技有限公司；荧光多功能显微镜：BX，日本OLYMPuS公司；CMIAS图像分析仪：CMIAS 98A，北京航空航天大学；石蜡切片机：RM2145，德国LEICA公司；image-pro plus图像处理系统6.0，美国Media Cybernetics公司。免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.4实验方法

1.4.1VCI大鼠的造模方法采用反复结扎双侧颈总动脉(CCA)造成缺血再灌注损伤(2VO)建立大鼠VCI模型[2]。腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠，钝性分离双侧CCA，用动脉夹夹闭双侧CCA造成脑缺血，夹闭10 min，再灌注20 min，反复3 次，缝合切口，术后行抗感染治疗。假手术组只行CCA分离，不夹闭血管。

1.4.2分组及给药方法筛选术后造模成功大鼠48只，随机分为4组：何首乌高剂量组、何首乌中剂量组、何首乌低剂量组、VCI模型组，每组12只大鼠。另有12只假手术大鼠作为正常对照组(假手术组)。造模成功后对大鼠用灌胃器灌胃，灌胃液体温度为20 ℃，何首乌高、中、低剂量组分别给予4.0 g/mL、2.0 g/mL、0.5 g/mL何首乌溶液灌胃，模型组、假手术组均给予生理盐水灌胃，灌胃剂量按1 mL/(100 g·d)，共28 d。

1.4.3学习记忆能力测定采用Morris水迷宫方法[3]。实验前将大鼠放入水中进行适应性训练。术后28 d各组大鼠开始行Morris水迷宫实验：①定位航行实验，历时5 d，每天4次，大鼠面向池壁从A、B、C、D入水点放入水中，观察其在2 min内寻找到并爬上平台的时间(逃避潜伏期)，若2 min未找到平台，实验者将其牵引至平台上，停留10 s后放回笼中，潜伏期记为最高2 min。②空间探索实验：第6天撤除平台，任选一个入水点放入大鼠，测量2 min内大鼠在目标象限和其他象限的游泳时间、穿越目标(原平台)次数[4]。

1.4.4免疫组织化学检测Bcl-2、Bax阳性细胞的表达行为学测试结束后，各组大鼠行心脏灌注术，以0.4%的戊巴比妥钠(1 mL/100 g)腹腔麻醉，立即开胸暴露心脏。左心室迅速插管至主动脉，同时剪开右心室，灌注生理盐水，速度先快后慢，直至舌尖、肝脏变白，大鼠四肢僵硬为满意，迅速取脑，立即将脑置于4%多聚甲醛中浸置4 h～6 h，取视交叉后4 mm处至小脑前的脑组织，PBS漂洗，经乙醇常规脱水、二甲苯透明后，浸蜡包埋，5 mm厚切片，行免疫组化染色。

2结果

2.1何首乌对大鼠认知功能的影响

2.1.1定位航行实验随着训练次数增多，各组大鼠逃避潜伏期均有不同程度缩短。与假手术组相比，VCI模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长(P<0.01)；而与VCI模型组相比，何首乌中剂量组、何首乌高剂量组大鼠逃避潜伏期明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表1。

表1　各组大鼠逃避潜伏期比较(±s) 　 s

2.1.2空间探索实验与假手术组相比，VCI模型穿越目标象限时间明显缩短(P<0.01)，穿越平台次数明显减少(P<0.01)；与VCI模型组相比，何首乌中剂量组、何首乌高剂量穿越目标象限时间明显延长，穿越平台次数明显增加，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表2。

表2　各组大鼠空间探索实验结果比较(±s)

2.2各组大鼠海马Bcl-2、Bax免疫组化结果Bcl-2、Bax免疫阳性细胞胞浆内出现棕黄色颗粒，即免疫组化染色的阳性表达成分。VCI模型组阳性细胞着色增强，数量明显增加，其中Bax变化更为显著，Bcl-2/Bax的比值较假手术组明显降低。何首乌高剂量组、何首乌中剂量组Bcl-2、Bax阳性细胞也有增加，着色增深，尤其Bcl-2变化显著，Bcl-2/Bax的比值较假手术组明显增高。何首乌低剂量组与VCI模型组比较无显著意义(P>0.05)。详见表3。

表3　各组大鼠海马Bcl-2、

3讨论

VCI是指由脑血管病危险因素、明显或不明显的脑血管病引起的，从轻度认知功能损害到痴呆的一大类综合征，涵盖了VCI从轻到重的整个发病过程。脑部微循环障碍导致神经元凋亡是其发生的共同通道[5]，主要病理变化是认知相关脑区如额叶、颞叶、杏仁体、丘脑等处明显的血管性病变、局灶性神经元损伤和脑白质损伤[6]。随着年龄的增长，VCI的发病率和患病率有逐渐增加的趋势[7]。

VCI属中医“呆病”范畴，基本病机是肾精亏虚、瘀血阻络，治疗当以补肾填精、化瘀通窍为主。何首乌是传统医学中常用来益智、抗衰老、改善记忆力的名贵中草药。二苯乙烯苷是何首乌中特有的生物活性成分，其含量目前已经成为何首乌药材的专属性指标，其具有抗氧化、清除自由基、降血脂、抗动脉粥样硬化及促智等作用。相关研究表明，何首乌对丘脑神经元有保护、改善学习记忆的作用[8]。

Bcl-2家族是细胞凋亡机制中重要的调节因子，Bcl-2、Bax是这一家族中重要成员，根据结构和功能分为凋亡抑制因子和促凋亡诱导因子，其中Bcl-2是最主要的凋亡抑制因子，而Bax是最主要的凋亡促进因子[9]。Bcl-2基因是一种重要的内源性抗凋亡因子，过度表达后可抑制由于氧自由基、兴奋性氨基酸等诱发的神经细胞凋亡。Bax为重要促凋亡基因，其诱导凋亡的机制是Bax同源二聚体的形成，Bcl-2蛋白的抑制凋亡作用则要通过与Bax结合形成异源二聚体来实现[10]。

本实验行为学结果显示，术后28 d VCI模型大鼠出现明显的学习记忆障碍，表现为逃离潜伏期的延长和在目标象限中游泳时间的缩短以及穿越平台次数的减少。而与VCI模型组相比，何首乌中剂量组、何首乌高剂量组大鼠逃避潜伏期明显缩短，穿越目标象限时间明显延长，穿越平台次数明显增加，表明中、高剂量何首乌对VCI模型大鼠的学习以及认知能有一定改善作用。而在本实验中各组VCI大鼠造模28 d完成行为学试验后，海马区Bcl-2和Bax蛋白表达显著高于假手术组。而何首乌高剂量组、中剂量组与VCI模型组相比，Bcl-2蛋白表达增加的幅度明显大于Bax蛋白，即虽然Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达均升高，但Bcl-2蛋白增加的更为明显，发挥了Bcl-2作为内源性神经保护物质高表达后抑制神经元凋亡的作用。本研究提示，何首乌通过调节Bcl-2、Bax蛋白表达来抑制细胞凋亡，从而改善VCI大鼠的学习以及认知能力。对临床中延缓VCI向VD发展有着重要意义；同时对何首乌以及何首乌为主的传统名方的挖掘、中药治疗慢性疾病以及新药的开发都有着重要的指导意义。

参考文献：

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[3]叶翠飞，张丽，艾厚喜，等．两种水迷宫实验对拟痴呆模型动物学习记忆功能测试的比较[J]．中国行为医学科学杂志，2004，13(3)：256-261．

[4]胡意员，周利飞，何金彩，等.长期高脂饮食对大鼠认知功能及情绪的影响[J].温州医学院学报，2013，43(4)：241-244；248.

[5]Tomimoto H.Vascular cognitive impairment：the relationship between hypertensive small vessel disease and cerebral amyloid angiopathy[J].Brain Nerve，2012，64(12)：1377-1386.

[6]Gorelick PB，Pantoni L.Advances in vascular cognitive impairment[J].Stroke，2013，44(2)：307-308.

[7]Rockwood K，Howard K，Mac Knight C，et al.Spectrum of disease in vascular cognitive impairment[J].Neuroepidemiology，1999，18：248-254.

[8]易传安，汪冶，胡祥上，等.何首乌提取物对血管性痴呆大鼠5-HT受体及生化指标的影响[J].中国老年学杂志，2014，34(2)：945-947.

[9]Tichy A．Apoptotie machinery：the Bcl-2 family protein in the roleof inspectors and superintendents[J].Acta Medica(Hradec Kralove)，2006，49(1)：13-18．

[10]Zhu Y，Prehn JH，Culmsee C，et al．111e beta2-adrenoceptor agonistclenbuterol modulates Bcl-2，Bcl-2 and Bax protein expression following transient forebrain ischemia[J]．Neuroscience，1999，90(4)：1255．

(本文编辑郭怀印)

The Influence of Polygonum on Learning and Memory Function in Rats with Vascular Cognitive Impairment

Wang Zhouyi，Xia Guangming，Zhou Gang，Xiao Zhanchi，Huang Huxiang，Chen Haote，Li Gang

Huanggang Central Hospital，Huanggang 438000，Hubei，China

Abstract：ObjectiveTo investigate the impact of polygonum on learning and memory function in rats with vascular cognitive impairment(VCI).MethodsForty-eight VCI model rats were randomly divided into four groups，namely polygonum high dose group，middle dose group，low dose group，VCI model groups.Another 12 sham-operated rats served as normal controls.After a successful modeling by gavage to rats is fed，fed a liquid temperature of 20 ℃，polygonum each treatment group were given different groups according to different concentrations of Polygonum solution mice in the model group，sham group were normal saline irrigation stomach，a total of 28 days.After 28 days the rats began to Morris water maze learning and memory ability behavioral tests，behavioral tests after the end of the line expression of Bcl-2 immunohistochemistry，Bax positive cells.ResultsCompared with the model group，escape latency was significantly shorter in polygonum middle dose group，high dose group(P<0.05 or P<0.01).The time of crossing the target quadrant was prolonged，the number of across the platform increased significantly(P<0.05 or P<0.01).After 28 days of modeling，the expressions of hippocampus Bcl-2 and Bax protein in each group was significantly higher than that in sham group.Compared with the model group，the magnitude of the increase Bcl-2 protein expression was significantly greater than the Bax protein in polygonum middle dose group，high dose group(P<0.05 or P<0.01).ConclusionPolygonum can inhibit apoptosis by regulating the Bcl-2，Bax protein expression，and improve the learning and cognitive ability in rats with VCI.

Key words：vascular dementia；polygonum；learning and memory function；Bcl-2；Bax

(收稿日期：2015-12-16)

Corresponding Author：Li Gang

中图分类号：R749.1R285.6

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.09.011

文章编号：1672-1349(2016)09-0960-03

通讯作者：李钢，E-mail：38449259@qq.com

基金项目：湖北省自然科学基金面上项目(No.2013CFC053)