芎芷地龙汤对偏头痛模型大鼠脑组织c-fos和CGRP蛋白表达的影响

赵永烈，王玉来，岳广欣

1.北京中医药大学东方医院(北京 100078)，E-mail：yongy3@126.com；2.北京中医药大学第三附属医院(北京 100029)；3.中国中医科学院



芎芷地龙汤对偏头痛模型大鼠脑组织c-fos和CGRP蛋白表达的影响

赵永烈1，2，王玉来1，岳广欣3

1.北京中医药大学东方医院(北京 100078)，E-mail：yongy3@126.com；2.北京中医药大学第三附属医院(北京 100029)；3.中国中医科学院

摘要：目的 观察芎芷地龙汤对偏头痛模型大鼠脑组织c-fos和降钙素基因相关肽(CGRP)蛋白表达的影响，探讨芎芷地龙汤对偏头痛的作用机制。方法将健康雄性SD大鼠48只，随机分为生理盐水组、模型组、舒马普坦组、中药治疗组，每组12只，给药干预后，皮下注射硝酸甘油注射剂10 mg/kg制作偏头痛动物模型，在皮下注射药物后4 h、6 h两个时间点取材，免疫组化法测定三叉神经脊束核和中脑导水管周围灰质c-fos和CGRP免疫阳性细胞表达情况。结果三叉神经脊束核阳性细胞表达：中药治疗组c-fos、CGRP阳性细胞数在4 h和6 h两个时间点均较模型组显著减少(P<0.01)；导水管周围灰质阳性细胞表达：中药组c-fos、CGRP阳性细胞数在4 h和6 h两个时间点与模型组比较均显著性减少(P<0.01)。结论 芎芷地龙汤可减少NTG诱发的三叉神经脊束核c-fos免疫阳性细胞表达，进而减弱三叉神经血管系统的激活，也可减弱中脑导水管周围灰质c-fos免疫阳性细胞表达，阻止伤害性信息的进一步传递；可减少三叉神经脊束核和中脑导水管周围灰质CGRP阳性细胞的表达。

关键词：偏头痛；动物模型；芎芷地龙汤；三叉神经脊束核；导水管周围灰质；降钙素基因相关肽

已经证实降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)在偏头痛功能失调和头痛产生过程中发挥重要作用[1]，CGRP正是通过外周炎症和中枢调节来提高偏头痛病人的神经传递[2]，认为CGRP是偏头痛发病的一个关键因子[3]。在过去十几年中进行的临床试验已经证明，CGRP受体拮抗剂可有效地治疗偏头痛。三叉神经脊束核释放的CGRP作用于表达CGRP受体的三叉神经元[4]，此区域对偏头痛来说是尤其重要[5]。

细胞原癌基因Fos(c-fos)是神经元受伤害性刺激激活的标志物，c-fos蛋白的表达已被广泛用于识别神经元激活区域，并研究伤害性刺激与神经的相关性[6]，三叉神经脊束核尾侧亚核(TNC)c-fos蛋白表达的增加，可以作为三叉神经血管系统激活的标志[7]。

中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray，PAG)是下行疼痛抑制系统的一个关键组成部分，也是情绪行为和自主神经控制的结构。它接收来自皮层的传入信息，并投射到下丘脑和中缝核[8-9]，参与偏头痛的发病过程。磁共振成像(MRI)研究发现，发作性偏头痛和慢性偏头痛病人PAG铁沉积[10]和组织密度[11]增加，PAG损害能激发偏头痛样的发作[12]，给实验动物PAG中注射特效抗偏头痛药如曲坦类药物，可抑制由硬脑膜刺激所诱导的三叉神经伤害感受器反应[13]。

前期研究观察了芎芷地龙汤对偏头痛模型有镇痛、镇静作用[14-15]，为进一步研究其作用机制，本实验以硝酸甘油诱发偏头痛动物模型，观察在偏头痛痛觉传道通路上三叉神经脊束核和导水管周围灰质中c-fos和CGRP的蛋白表达情况，研究芎芷地龙汤对c-fos和CGRP蛋白表达的影响。

1材料与方法

1.1药品与试剂芎芷地龙汤(川芎、白芷、生石膏、地龙、元胡)由北京中医药大学东方医院制剂室提取(每毫升含生药1.8 g)；硝酸甘油注射液(5 mg/mL)，北京益民药业有限公司生产；琥珀酸舒马普坦片(每片25 mg)，海南先声药业有限公司生产；戊巴比妥钠、多聚甲醛购自北京化学试剂公司；磷酸缓冲液(PBS，0.01 mol/L pH 7.2～7.4)、DAB显色剂、AEC显色剂、双染增强剂、抗体稀释液、CLEARMOUNTTM封片剂、Triton X-100、即用型SP-9001免疫组化检测试剂盒、兔抗大鼠c-fos抗体，以上试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗大鼠CGRP抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2动物健康雄性SD大鼠，清洁级，48只，体重250 g～270 g，由维通利华公司实验动物中心提供。动物许可证号：SCXK(京)2006-0009。

1.3实验仪器CM1850恒温冷冻切片机，德国LEICA公司生产；BX51M 显微镜，日本OLYMPUS公司生产。

1.4动物分组所有实验动物在同一条件下适应性喂养，按照随机性原则分为4组：生理盐水组、模型组、舒马普坦组、中药治疗组，每组12只。

1.5造模及给药动物适应性喂养1周，参照文献制作动物模型。生理盐水组连续灌胃给予生理盐水3 d，第3 天灌胃给予生理盐水后30 min，皮下注射生理盐水2 mL/kg。模型组连续灌胃给予生理盐水3 d，第3天灌胃给予生理盐水后30 min，皮下注射硝酸甘油注射剂10 mg/kg(2 mL/kg)。舒马普坦组连续灌胃给予琥珀酸舒马普坦(6 mg/kg)3 d，第3天灌胃给予琥珀酸舒马普坦后30 min，皮下注射硝酸甘油注射剂10 mg/kg(2 mL/kg)。中药治疗组连续灌胃给予芎芷地龙汤(10.8 g/kg)3 d，第3天灌胃给予芎芷地龙汤后30 min，皮下注射硝酸甘油注射剂10 mg/kg(2 mL/kg)。

1.6取材与处理动物皮下注射硝酸甘油注射剂或生理盐水后，分两个时间点即4 h、6 h采集标本。在戊巴比妥钠60 mg/kg 腹腔注射麻醉下迅速开胸经左心室穿刺作升主动脉插管，同时剪开右心耳。先快速灌注生理盐水100 mL～200 mL(4 ℃)至肝脏完全变白，右心耳流出澄清液体后，继之灌入含4%多聚甲醛0.1 mol/L 的 PBS(pH 7.4)(4 ℃)200 mL～400 mL，先快后慢灌注，至大鼠肝脏变硬，肢体僵直，即固定完成，时间1 h～2 h。完整取出鼠脑后投入4%多聚甲醛0.1 mol/L 的 PBS(pH 7.4)(4 ℃)过夜固定，然后置于含20%蔗糖的多聚甲醛溶液中直至脑组织沉底，即可行冰冻切片。

1.7切片恒冷切片机中(-25 ℃)，按《大鼠脑立体定位图谱》，于前囟后方6.6 mm～7.6 mm和12.8 mm～13.8 mm连续冠状切片，片厚20 μm，隔5张取一张。切片收集于0.01 mol/L的PBS(pH 7.4)中待染。按照试剂盒说明书进行免疫双标染色。

1.8阳性细胞计数及图像分析在10倍物镜下观察每张切片的c-fos阳性细胞和CGRP阳性细胞，c-fos染色暗红色沉淀位于细胞核内认为是阳性，CGRP染色棕褐色沉淀位于细胞浆内认为是阳性，并只记录有明显染色的神经元，以Image-pro Plus5.0图像分析系统采集图像和分析，记录各组图像阳性细胞数。

2结果

2.1各组三叉神经脊束核c-fos和CGRP蛋白共存表达模型组c-fos阳性细胞数和CGRP阳性细胞数增多，4 h多于6 h，两个时间点的阳性细胞数与生理盐水组比较差异有统计学意义(P<0.01)。中药治疗组和舒马普坦组c-fos阳性细胞数和CGRP阳性细胞数减少，4 h多于6 h，两个时间点的阳性细胞数与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，与生理盐水组比较差异无统计学意义。详见表1。

表1　各组三叉神经脊束核c-fos和CGRP蛋白表达(±s)

2.2各组导水管周围灰质c-fos和CGRP蛋白共存表达模型组c-fos阳性细胞数增多，4 h多于6 h，两个时间点的阳性细胞数与生理盐水组比较差异有统计学意义(P<0.01)；CGRP阳性细胞数增多，4 h少于6 h，两个时间点的阳性细胞数与生理盐水组比较差异有统计学意义(P<0.01)。中药治疗组和舒马普坦组c-fos阳性细胞数减少，4 h稍多于6 h，两个时间点的阳性细胞数与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，与生理盐水组比较差异无统计学意义；中药治疗组和舒马普坦组CGRP阳性细胞数减少，两个时间点的阳性细胞数与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，与生理盐水组比较差异无统计学意义；中药组CGRP阳性细胞数4 h稍多于6 h，舒马普坦组CGRP阳性细胞数6 h多于4 h。详见表2。

表2　导水管周围灰质c-fos和CGRP蛋白表达(±s)

3讨论

近年研究认为，头痛涉及三叉神经血管系统[16-18]，三叉神经的初级传入神经支配软脑膜和硬脑膜血管，其传出投射纤维与脑干的三叉神经脊束核尾侧部(TNC)二级神经元联系，TNC的神经元纤维投射到涉及伤害性痛觉的大脑结构，包括丘脑核、导水管周围灰质尾侧腹外侧区域。导水管周围灰质不仅通过上行纤维投射到丘脑，也通过下行纤维调节伤害性痛觉信息的传递。在三叉神经血管系统内，最丰富的神经肽是降钙素基因相关肽，在三叉神经节内有35%～50%的神经元表达降钙素基因相关肽[19]。在近十几年的研究中发现，CGRP在偏头痛发病中起着的关键作用[20-21]。有三种临床证据支持这一观点：第一是偏头痛发作期病人颈静脉血中CGRP水平升高[22]，第二是静脉注射CGRP引起中度到重度头痛，这种头痛与实验诱发的标准偏头痛相符[23-25]，第三是偏头痛病人体内的CGRP与可有效治疗偏头痛的选择性CGRP受体拮抗剂有关。这些药物既能缓解疼痛又能缓解偏头痛相关症状，这为CGRP是一个治疗偏头痛有效靶点提供了确切的证据[3]。

在本实验中观察到，给予NTG后，动物三叉神经脊束核和中脑导水管周围灰质c-fos阳性细胞大量表达，以4 h为最高，与文献报道相一致[26]。经过给药干预后，中药治疗组和舒马普坦组动物三叉神经脊束核和中脑导水管周围灰质c-fos免疫阳性细胞共存表达减少，证实了芎芷地龙汤可减少c-fos在中枢部的表达，减弱三叉神经脊束核和导水管周围灰质中传导伤害性痛觉冲动神经元的活性；给予NTG后，动物三叉神经脊束核和中脑导水管周围灰质CGRP阳性细胞大量表达，也以4 h为最高，在数量上接近c-fos阳性细胞表达的2倍，给予药物干预后，中药治疗组和舒马普坦组动物三叉神经脊束核和中脑导水管周围灰质CGRP免疫阳性细胞共存表达减少，两个时间点的阳性细胞数与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，与生理盐水组比较差异无统计学意义，本实验研究结果与既往研究结果相一致[27]，表明芎芷地龙汤和舒马普坦可减少三叉神经脊束核和导水管周围灰质CGRP阳性细胞表达。

综上所述，芎芷地龙汤可减少NTG诱发的三叉神经脊束核c-fos免疫阳性细胞表达，进而减弱三叉神经血管系统的激活，也可减弱中脑导水管周围灰质c-fos免疫阳性细胞表达，阻止伤害性信息的进一步传递；可减少三叉神经脊束核和中脑导水管周围灰质CGRP阳性细胞的表达，这为芎芷地龙汤治疗偏头痛的靶点提供了客观证据。

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(本文编辑郭怀印)

The Influence of Xiongzhi Dilong Decoction on the Expressions of c-fos and CGRP Immunoreactive Neurons in Brain Tissues of Migraine Model Rats

Zhao Yonglie，Wang Yulai，Yue Guangxin

Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China

Abstract：ObjectiveTo observe the infcuence of Xiongzhi Dilong decoction(XDD) on the expressions of c-fos and calcitonin gene-related peptide(CGRP)immunoreactive neurons in brain tissues of migraine model rats，and to explore its mechanism.MethodsForty-eight healthy male Sprague-Dawley(SD) rats were divided randomly and equally into 4 groups：saline group，migraine model group，sumatriptan group，XDD group.The rats were pretreated with sumatriptan，XDD or saline before received a subcutaneous injection of 10 mg/kg nitroglycerin or saline.After the rats received a subcutaneous injection 4 h and 6 h，the brain tissue samples were collected.Immunohistochemistry was applied to detect c-fos and CGRP immunoreactive neurons in trigeminal nucleus caudalis(TNC)and periaqueductal gray(PAG).ResultsImmunoreactive positive neurons in trigeminal nucleus caudalis：c-fos immunoreactive neurons and CGRP immunoreactive neurons in XDD group were decreased at both 4 h and 6 h，and there was statistical difference comparing with the migraine model group(P<0.01).Immunoreactive positive neurons in periaqueductal gray(PAG)：c-fos immunoreactive neurons and CGRP immunoreactive neurons in XDD group were decreased at both 4 h and 6 h，and there was statistical difference comparing with the migraine model group(P<0.01) as well.ConclusionXDD can reduce the NTG-induced c-fos immunoreactive neurons in trigeminal nucleus caudalis，and attenuate the activatin of trigeminovascular system，can reduce the CGRP immunoreactive neurons in periaqueductal gray as well，and inhibit nociceptive transmission.XDD can reduce the CGRP immunoreactive neurons in trigeminal nucleus caudalis and periaqueductal gray.

Key words：migraine；animal models；Xiongzhi Dilong decoction；spinal trigeminal nucleus；periaqueductal gray matter；calcitonin gene-related peptide

(收稿日期：2015-12-06)

中图分类号：R741R285.5

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.09.010

文章编号：1672-1349(2016)09-0957-04

基金项目：国家自然科学基金项目(No.81373591)