脑心通对氧化低密度脂蛋白诱导血管平滑肌细胞增殖和自噬的影响

邱伟文，郑丽云，邬至平，蔡学礼，彭潇，黄跃金，黄良通（丽水市中心医院 神经内科，浙江 丽水 323000）



脑心通对氧化低密度脂蛋白诱导血管平滑肌细胞增殖和自噬的影响

邱伟文，郑丽云，邬至平，蔡学礼，彭潇，黄跃金，黄良通
（丽水市中心医院 神经内科，浙江 丽水 323000）

［摘 要］目的：观察脑心通对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和自噬相关蛋白Beclin1、LC3表达的影响，探讨其抗动脉粥样硬化（AS）的可能机制。方法：将人脐动脉VSMC分为：对照组、ox-LDL组、脑心通组、ox-LDL+脑心通组。采用噻唑蓝（MTT）法和克隆形成实验检测细胞增殖作用，Western blot法检测自噬相关蛋白Beclin1与LC3表达水平的改变。结果：ox-LDL显著促进VSMC的增殖和克隆形成，而脑心通对VSMC的增殖和克隆形成无明显作用，但其抑制ox-LDL对VSMC增殖和克隆形成的促进作用。Western blot结果显示ox-LDL显著增加VSMC自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达水平；脑心通抑制ox-LDL增加的Beclin1和LC3的表达。MTT法检测发现自噬抑制剂3MA抑制ox-LDL对VSMC的增殖作用。结论：脑心通可能通过降低VSMC自噬抑制ox-LDL对VSMC的增殖作用。

［关键词］脑心通；氧化低密度脂蛋白；细胞自噬；血管平滑肌细胞

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种严重危害人类健康的常见病，是冠心病、脑血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心脑血管病的主要病理基础。AS的发病机制存在多种学说，涉及多种危险因素，临床尚缺乏有效的防治药物。脑心通是一种中成药，已广泛应用于治疗心脑血管疾病，具有抗AS、保护血管内皮细胞、稳定AS易损斑块、保护缺血再灌注损伤神经及抑制神经细胞凋亡的作用［1］。娄莉等［2］研究表明脑心通能明显抑制氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）诱导血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）增殖作用，然而脑心通的作用机制仍未明确。自噬是广泛存在于真核细胞中的细胞生物学行为，是一种进化上高度保守的、用于降解和回收利用细胞内生物大分子和受损细胞器的过程，是细胞进行自我保护的一种重要机制，在维持细胞存活、更新、物质再利用和内环境稳定中起着重要作用，并参与细胞的增殖、凋亡、迁移等过程［3］。本研究通过噻唑蓝（MTT）法、克隆形成和Western blot方法检测细胞自噬在脑心通抑制ox-LDL诱导VSMC增殖中的作用，探讨脑心通抗AS的可能机制。

1　材料和方法

1.1材料 人脐动脉VSMC购买于上海生命科学细胞库；脑心通由陕西步长制药有限公司提供，国药准字Z20025001；ox-LDL购买于北京协和生物科技有限公司；鼠源性抗体Tubulin购买于Sigma公司；Beclin1、LC3单克隆抗体购买于CST公司；MTT、3MA购买于Sigma公司。

1.2方法

1.2.1人脐动脉VSMC培养：使用含体积分数10%胎牛血清MEM培养液，在细胞培养皿内接种细胞后置入37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，取对数期、增殖旺盛细胞进行连续培养。

1.2.2MTT法检测细胞增殖：将增殖的VSMC分为对照组、ox-LDL组、脑心通组、ox-LDL+脑心通组。取对数生长期的VSMC，调细胞密度为2×104/mL，接种于96孔培养板，每孔200 μL。细胞贴壁之后，弃去培养液，然后加入不同处理条件培养基，对照组不加药，并设置调零孔，每组设置6个复孔，培养48 h后，每孔加入20 μL MTT，37 ℃恒温箱孵育4 h后，弃去上清液，加入DMSO 120 μL终止反应。 以调零孔光密度值（OD）调零校准，用酶联免疫检测仪在492 nm波长处测各孔的OD值。

1.2.3细胞克隆形成：取对数生长期各组细胞，胰蛋白酶消化后，台盼蓝作活细胞计数，调整细胞浓度，将调整后的细胞悬液接种于6孔板，每孔500个细胞。置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的温箱中培养10 d，每隔3 d更换一次培养基。弃生长液，PBS漂洗2次，4%多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色液染色30 min。显微镜下计细胞集落数（集落标准：含有50个以上细胞的细胞团为一个细胞集落）并照相。

1.2.4Western blot法检测信号通路改变：不同条件处理VSMC后，预冷PBS漂洗2次，随后加入细胞裂解液冰上裂解15 min，12 000 r/min离心15 min，吸取上清。BAC法进行蛋白定量，取20 μg总蛋白4%～12%聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳分离，电转至PVDF膜上，3%脱脂牛奶室温封闭1 h。加入一抗4 ℃孵育过夜，随后PBST缓冲液洗膜3次，每次8 min，加入HRP标记的二抗室温孵育1～2 h，PBST缓冲液再次洗膜3次，每次8 min，ECL试剂发光、显影和定影，ImageJ软件分析，以Tubulin为内参，目标条带与内参灰度值的比值反映相关蛋白的相对表达值。

1.3统计学处理方法 采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理。计量资料以±s表示，采用单因素方差分析进行显著性检验，各观察值间的多个样本均数的两两比较采用最小显著性差异t（LSD-t）检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1脑心通抑制ox-LDL的促进VSMC增殖的作用

ox-LDL组中，0～60 mg/L ox-LDL呈剂量依赖性促进VSMC增殖，OD值分别为：0.77±0.05（0 mg/L）、0.97±0.01（20 mg/L）、1.09±0.05（40 mg/L）、1.31±0.11（60 mg/L）；脑心通组中，0.2～0.8 g/L脑心通对VSMC的活性无明显抑制作用，脑心通（0～0.8 g/L）呈剂量依赖性抑制ox-LDL（40 mg/L）对VSMC增殖的促进作用，OD值分别为：0.85±0.11（0 g/L）、1.14±0.09（0.2 g/L）、1.06±0.07（0.4 g/L）、0.75±0.08（0.8 g/L），见图1。各组细胞克隆形成率分别为：100%（对照组）、185.5%±3.1%（40 mg/L ox-LDL组）、102.4%±2.6%（0.8 g/L脑心通组）、105.4%±1.6%（40 mg/L ox-LDL+0.8 g/L脑心通组），与对照组相比，40 mg/L的ox-LDL克隆形成明显增高（P＜0.01），0.8 g/L脑心通对VSMC的克隆形成无明显作用，但与40 mg/L ox-LDL相比，0.8 g/L脑心通抑制ox-LDL促进VSMC的克隆形成（P＜0.05），见图2。

2.2脑心通抑制ox-LDL诱导的VSMC自噬激活作用

Beclin1和LC3表达是细胞发生自噬的关键蛋白，反映细胞自噬强度。Western blot结果显示，ox-LDL组与对照组比，不同剂量ox-LDL呈剂量依赖性增加VSMC自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达，而ox-LDL+脑心通组中，脑心通能够明显抑制ox-LDL诱导的细胞自噬相关蛋白Beclin1和LC3表达，见图3。

2.3自噬抑制剂3MA抑制ox-LDL诱导的VSMC增殖

为进一步证明自噬的作用设立自噬抑制剂ox-LDL+ 3MA组，MTT法结果显示，对照组、ox-LDL组、ox-LDL+ 3MA组的OD值分别为：0.95±0.11、1.32±0.10［与对照组比，差异有统计学意义（P＜0.05）］、0.85± 0.6［与对照组比，差异无统计学意义（P＞0.05）］，3MA抑制ox-LDL诱导的VSMC增殖，见图4。

3　讨论

图1　脑心通抑制ox-LDL的促VSMC增殖作用

ox-LDL是AS的重要危险因子，诱发血管内皮损伤，参与AS的发生与发展。脑心通是一种用于治疗各种心脑血管疾病的中成药，其治疗效果已经得到广泛认同。研究表明脑心通明显抑制ox-LDL诱导的VSMC增殖作用，但其内在机制仍未完全明确。本研究探讨脑心通调节细胞自噬抑制ox-LDL诱导的VSMC增殖作用。

图2 各组细胞克隆形成图

AS是血管壁内皮细胞、脂质、单核巨噬细胞、VSMC及血小板相互作用而导致的慢性炎性反应，是众多心脑血管疾病共同的病理基础，严重危害人类健康［4］。自噬是维持细胞存活、更新、物质再利用和内环境稳定的重要活动过程［5］。自噬功能紊乱参与多种疾病的发生。目前自噬参与AS形成的观点已得到广泛认同。有研究［6］表明自噬在AS形成过程起重要保护作用，而且泡沫细胞自噬功能混乱导致血管炎症发生，加速AS形成［7］。尽管自噬如何影响AS形成尚未完全明确，但多种调节细胞自噬功能的药物已应用于预防和治疗AS，如雷帕霉素、依维莫司、丹酚酸B、黄芩、射干苷等［8］。

脑心通作为一种中成药物，由黄芪、水蛭、地龙、全蝎、当归、川芎、丹参、红花、赤芍、桂枝、牛膝等16种中药制成，具有益气活血、健脾化痰、化瘀通络等功效，有抗AS、保护血管内皮细胞损伤、稳定AS易损斑块作用和保护缺血再灌注损伤神经及抑制神经细胞凋亡的作用［9］。席东焱［10］研究表明脑心通具有保护血管内皮细胞和改善血小板功能的作用；刘振权等［11］研究发现脑心通对大鼠脑微血管内皮细胞模拟脑缺血损伤有保护作用，其机制可能与抗脂质过氧化作用有关。目前脑心通对VSMC作用的研究较少，娄莉等［2］研究发现脑心通能明显抑制ox-LDL诱导VSMC增殖作用。本研究结果显示有效剂量的脑心通对VSMC无明显毒性作用。ox-LDL明显促进VSMC的增殖，脑心通抑制ox-LDL促进VSMC增殖作用，这与之前的文献报告一致。

在细胞因子、炎性反应、趋化因子、生长因子及致病因素等作用下，VSMC发生细胞增殖和功能转变［12］。ox-LDL是AS的重要危险因子，能够促进VSMC增殖和功能转变［13］。Li等［14］研究发现c-Ski抑制ox-LDL和血小板源性生长因子对VSMC自噬和增殖的促进作用。Ding等［15］研究发现低浓度（10～40 μg/mL）ox-LDL促进自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I、Beclin1与Atg5的表达和细胞增殖，而高浓度（60 μg/ mL）ox-LDL抑制自噬，促进VSMC凋亡。Grootaert等［16］研究发现Atg7敲除诱发的细胞自噬缺陷加速VSMC死亡，促进内膜和粥样斑块形成。因此，ox-LDL促进VSMC增殖可能与其促进细胞自噬激活有关。和LC3的表达增高，同时降低了ox-LDL诱导的VSMC增殖，这一作用与自噬抑制剂3MA对ox-LDL诱导的VSMC增殖相同。

图3 ox-LDL和脑心通对Beclin1和LC3表达的影响

图4　MTT法检测VSMC增殖结果

综上所述，脑心通降低VSMC自噬活性，抑制ox-LDL促进VSMC增殖和细胞自噬相关蛋白Beclin1和LC3表达，这一过程可能参与脑心通抗AS的作用。

参考文献：

Beclin-1是哺乳动物参与自噬的特异性基因，与III型磷脂酰肌醇-3激酶形成复合物参与自噬体形成，是自噬形成和成熟的标志。LC3位于前自噬泡和自噬泡膜表面，参与自噬形成，存在I型和II型2种分子。发生自噬时，细胞质内的LC3I型与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺结合形成LC3II型，是自噬体的标示，用LC3II/LC3I比值表示细胞自噬强度。本研究结果显示ox-LDL增高了VSMC中LC3和Beclin1的表达；而脑心通抑制ox-LDL诱导VSMC的Beclin1

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（本文编辑：赵翠翠，丁敏娇）

The effects of naoxintong on vascular smooth muscle cells proliferation and autophagy induced by oxidized low-density lipoprotein

QIU Weiwen，ZHENG Liyun，WU Zhiping，CAI Xueli，PENG Xiao，HUANG Yuejin，HUANG Liangtong. Department of Neurology，Lishui Central Hospital，Lishui，323000

Abstract:Objective: To investigate the effects of naoxintong on the vascular smooth muscle cells （VSMC） proliferation and the expression of Beclin1 and LC3 induced by oxidized low-density lipoprotein （ox-LDL）. Methods: The VSMC were divided into four groups: control group，ox-LDL group，naoxintong group and ox-LDL+naoxintong group. MTT and colony formation assay was used to test the proliferation. Western blot was used to analysis the expression of Beclin1 and LC3. Results: ox-LDL significantly promoted the viability and colony formation of VSMC. Naoxintong had no effect on the proliferation and colony formation but inhibited the proliferation and colony formation of VSMC induced by ox-LDL. Western blot results demonstrated that ox-LDL significantly promoted the expression of Becli1 and LC3，naoxintong inhibited the expression of Beclin1 and LC3 induced by ox-LDL. Furthermore，MTT verified that autophagy inhibitors 3MA inhibited significantly the proliferation induced by ox-LDL. Conclusion: Naoxintong inhibited the VSMC proliferation induced by ox-LDL through inhibited the cell autophagy.

Key words:naoxintong； ox-LDL； autophagy； vascular smooth muscle cells

作者简介：邱伟文（1966-），男，浙江丽水人，副主任医师，硕士。

基金项目：浙江省医药卫生科技项目（2015KYB451）。

收稿日期：2016-01-07

［中图分类号］R285；R743.1

［文献标志码］A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.05.006