骨髓间充质干细胞对小鼠肝硬化模型的作用研究

牛艳君，李莹，吴永娜，严祥

（兰州大学第一医院，甘肃 兰州 730000，1.老年病科；2.甘肃省生物治疗与再生医学重点实验室）



骨髓间充质干细胞对小鼠肝硬化模型的作用研究

牛艳君1，李莹2，吴永娜2，严祥1

（兰州大学第一医院，甘肃 兰州 730000，1.老年病科；2.甘肃省生物治疗与再生医学重点实验室）

［摘 要］目的 探索小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的培养和其肝硬化模型的制备，以及两者之间的相互作用。方法 首先，提取小鼠骨髓，移至培养瓶中，根据全骨髓贴壁法的原理培养干细胞；然后，采用CCl4为主的方法对小鼠进行肝硬化模型的制备；最后，把培养成功的骨髓干细胞通过肝动脉和尾静脉途径移植治疗造模成功的肝硬化小鼠，观察疗效。结果 根据多种单克隆抗体的表达，使用流式细胞仪进行鉴定，成功培养小鼠骨髓间充质干细胞；对造模小鼠肝脏组织进行病理切片，病理报告图示典型的肝硬化，证明造模成功；通过肝动脉和尾静脉途径移植治疗肝硬化模型小鼠，最后报告干细胞治疗的病理结果，肝硬化程度减轻，说明骨髓间充质干细胞具有一定的疗效。结论 自体骨髓干细胞移植治疗肝硬化是有效的，但仍需要基础研究和大样本的临床数据。

［关键词］骨髓间充质干细胞；肝硬化模型；小鼠；移植

骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制的特点，而且来源广泛，易于分离培养，自体移植不会产生免疫排斥［1］。肝硬化是临床常见的慢性进行性肝病，病理组织学上有广泛的肝细胞坏死、残存肝细胞结节性再生，结缔组织增生与纤维隔形成，导致肝小叶结构破坏和假小叶形成，逐渐发展为肝硬化［2］。临床上多采用内科保守治疗，但效果欠佳［3］。BMSCs是肝硬化时肝细胞的主要来源，可以修复、补充缺损的肝组织，达到改善肝脏功能的目的。BMSCs移植治疗肝硬化是近年来研究的热点，与肝移植相比，具有取材方便、无排斥反应、安全性高及价格相对低廉等优点，为肝硬化患者的治疗提供了新的治疗手段［4］。本实验拟建立小鼠肝硬化模型，通过不同途径注射小鼠BMSCs，进行基础研究，为临床应用提供证据。

1　材料和方法

1.1实验动物

清洁级BALB/C小鼠，骨髓间充质干细胞的培养组为4只3日龄雄性乳鼠，肝硬化模型制备组为BALB/C雄性小鼠30只，体重为40～50 g，由甘肃省兽医研究所动物研究中心提供。

1.2主要试剂和仪器

F12培养基（Hyclone公司）、血清（Gibco公司）、双抗（青霉素及链霉素，Gibco公司）、0.25%的胰酶（含EDTA，Gibco公司）、PBS缓冲液、CD单克隆抗体（BD公司）、CCL4（兰州化工厂）、苯巴比妥钠（兰州大学第一医院）、色拉油（金龙鱼）、乙醇（北京二锅头）。Thermo二氧化碳培养箱、LICA倒置显微镜、流式细胞仪。

1.3方法

1.3.1骨髓间充质干细胞的培养：采用全骨髓贴壁培养方法进行BMSCs的培养。用颈椎脱臼法处死小鼠，放入70%乙醇的烧杯中，使其体毛完全浸湿5 min，将大鼠放在超净工作台消毒托盘内，用镊子夹其腹中部皮肤，沿中间作一切口，剪开腹壁各层；将切口拉至股骨，小心分离股骨上的肌肉，从关节两端剪断股骨，放在盛有PBS液平皿中，再次去除肌肉并用PBS液冲洗3次；将股骨中间剪断，用1 mL注射器吸取F12培养液（10%的血清、1%的双抗）反复冲洗骨髓腔，冲出骨髓到15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入培养液，吹打散细胞，接种到25 mL培养瓶中，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.3.2小鼠肝硬化模型的制备：小鼠先在实验室适应性饲养一周，不限食水。将小鼠进行随机分组，正常对照组10只和肝硬化模型实验组20只。实验组前两周为诱导期，苯巴比妥钠0.35 g/L当做饮用水使用，普通饲料喂养。之后6～8周的成模期，10% CCl4混合油溶液，剂量0.5 mL/100 g，皮下多点注射或腹腔注射，每周2次，10%乙醇为饮用水使用，普通饲料喂养，饲养过程注意体重变化，体重降低10%，改为正常饮用水使用。对照组普通饲料加清水喂养。1.3.3 BMSCs的移植：每只小鼠注入BMSCs 1 mL，细胞数量为3×105个，正常对照组不进行移植，实验组分为肝动脉和尾静脉两种途径移植BMSCs，各8只小鼠。（1）肝动脉途径：无菌手术条件下进行操作，暴露腹腔，找到肝总动脉、肝固有动脉和胃十二指肠动脉，在手术显微镜下，结扎胃十二指肠动脉远端，动脉夹阻断肝总动脉血流，胰岛素注射器在胃十二指肠动脉结扎的前方快速注入BMSCs悬液，结扎胃十二指肠动脉前端，复通肝总动脉，关闭腹腔。（2）尾静脉途径：固定住大鼠尾巴，用酒精棉球反复擦拭距尾巴根部2 cm处皮肤，使得尾静脉可见，1 mL注射器缓慢注入BMSCs悬液。移植后4周时间中，继续皮下注射10% CCl4溶液。

2　结果

2.1BMSCs的观察

培养箱放置48 h，进行换液，用PBS冲洗两次，加入适量的培养基，当细胞接近90%融合时，用胰蛋白酶进行消化，按1∶2的比例进行传代，倒置显微镜下进行观察细胞的形态，可见放射状排列的细胞集落，伸出长短不一、粗细不均的突起，梭形细胞为主，胞浆丰富，胞核大、核仁清晰，细胞生长旺盛，原代培养第6天显微镜结果见图1。

图1　倒置显微镜图（×200）

2.2BMSCs的鉴定

收获3代以内生长状态良好细胞，0.25%胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，用PBS（含1% BSA）清洗细胞3次，计数细胞，各管依次加入单克隆抗体CD90、CD105、CD29、CD14、CD31、CD11b、CD34、CD73、CD45。同时每管样品设立同型阴性对照。避光冰上孵育45 min，用PBS（含1% BSA）洗涤细胞3次，以除去未结合抗体，用500 μL PBS（含1% BSA）重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。流式细胞仪检测细胞表面标记结果显示CD105、CD73、CD29、CD90的阳性表达率≥95%，CD14、CD11b、CD34、CD45、CD31的阳性表达率≤2%，符合干细胞的基本特性。见图2。

2.3肝硬化小鼠造模结果

8～10周后，正常对照组的小鼠全部存活，毛发光泽，精神状态好，体重增加，对外界刺激反应敏感。肝硬化模型实验组小鼠死亡4只，其余毛发变黄，凌乱无光泽，精神萎靡，对外界刺激反应迟钝。肉眼观察小鼠肝脏表面形态、大小、颜色、质地，病理切片，行HE染色，显微镜下观察结果见图3～4。

图2　流式细胞图

图3　正常对照组小鼠肉眼和光镜下肝脏组织图片

图4　肝硬化模型实验组小鼠肉眼和光镜下肝脏组织图片

2.4BMSCs移植结果

实验过程中，肝动脉组2只小鼠死亡，尾静脉组1只小鼠死亡，其余实验组小鼠生活状态类似，未见明显的异常。4周后，处死小鼠，肉眼观察肝脏组织，进行病理组织切片和HE染色，结果显示肝硬化得到一定程度的改善，两种途径对肝硬化的效果无太大的差异。见图5～6。

3　讨论

关于小鼠BMSCs的基础研究方面，目前，培养BMSCs方法包括全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法、细胞表面分子标记分选法、红细胞裂解法等［5-6］，本实验所采用的全骨髓贴壁培养法，具有实验步骤少、细胞贴壁时间短、细胞数量多，可以更好的保持细胞的活性状态，并不改变胞形态、免疫表型等优势。实验过程中对BMSCs的鉴定首先通过倒置显微镜对其进行基本的形态学观察，一般情况下，细胞形态多数呈梭形、纤维状或纺锤状，细胞密度较高时成簇状聚集生长现象，会呈放射状排列；然后用流式细胞仪检测细胞表面标记，借助BMSCs表面抗原性，选择BMSCs较特异性标志的细胞表面的黏附分子，得到抗体的阴性和阳性表达率，从而判断所培养的细胞是否为干细胞。构建一种稳定、可靠、模拟性强的肝硬化小鼠模型，可以对此类疾病及其相关药理学实验进行研究，此类方法包括以CCl4为主诱导、CCl4和乙醇复合高脂肪饮食为主诱导、二甲基亚硝胺、硫代乙酞胺、酒精、血清免疫法等进行建立肝硬化模型［7-8］。本实验使用CCl4、乙醇复合高脂肪饮食为主诱导的肝硬化模型，其为多因素导致动物肝硬化，可节约时间、成功率高、死亡率低，具有简便易行、价廉及病变典型等优点，有助于研究外在因素对肝硬化进程的干预作用。

图5　BMSCs移植小鼠肉眼和光镜下肝脏组织图片

图6　BMSCs移植小鼠肉眼和光镜下肝脏组织图片

通过肝动脉和尾静脉两种途径对肝硬化小鼠进行BMSCs移植治疗，治疗效果相当，一方面可能因为解剖学特点，某种程度上影响了移植途径的选择，另一方面由于干细胞自身具有趋化和旁分泌作用，促使不同途径移植的干细胞都迁徙到损伤的肝脏，同时分泌的多种因子随血液循环进入肝脏，进一步改善肝脏功能，发挥生物学效应。由此可见，干细胞对肝硬化的治疗作用不完全取决于移植途径，可进一步试验多种移植途径对多种肝硬化动物模型的作用，从而获得更为完整的研究数据。

在临床上，BMSCs是肝硬化时肝细胞的主要来源，在特定环境下可分化成肝干细胞及肝细胞，为细胞移植治疗终末期肝病的靶细胞。BMSCs具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，被认为是引入临床治疗的最优干细胞［9-11］。陈阳述等［12］临床上针对33名肝硬化患者进行自体BMSCs移植治疗，结果发现肝脏代谢功能提高，同时患者腹胀、黄疸等症状显著改善，自体BMSCs经过体外分离再将其植入患者肝脏内，促进了内源性肝细胞的增殖过程，避免排斥反应，加快了肝组织的恢复。

BMSCs移植治疗肝硬化是国内外研究的热点，近年来对其研究逐渐深入，经过动物模型及临床的研究，已经证实其有效性，临床上成功治疗的案例，国内外均有报道。但是依旧存在需要探讨的问题，基础研究方面，缺乏特异性对人体无损害又便于跟踪的移植细胞标记物；临床应用方面，干细胞多种移植途径的效果和可行性仍需要临床上随机对照及双盲研究的治疗数据，以便得出更科学的结论。

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（本文编辑：张和，鲁翠涛）

·经验交流·

·论著 基础研究·

Research of bone marrow mesenchymal stem cells on the cirrhosis model in mice

NIU Yan-jun1，LI Ying2， WU Yong-na2， YAN Xiang1.1Department of Geriatrics；2Gansu Key Laboratory of Biotherapy and Regenerative Medicine， the First Hospital of Lanzhou University， Lanzhou 730000， China

AbstractObjective To explore the cultivation of mice bone marrow mesenchymal stem cells and the preparation of mice liver cirrhosis model， as well as the interaction of two methods. Methods First of all， the mice BMSCs were extracted to culture bottle， further separated and cultured in vitro； then， mice liver cirrhosis model was prepared by the approach of CCl4-based； finally， BMSCs were transplanted into mice liver cirrhosis model through the hepatic artery and tail vein. Results According to the expression of monoclonal antibodies， the mice BMSCs were identified by means of flow cytometry and cultured successfully； mice liver tissue was executed via pathological section， the pathological findings reported typical cirrhosis and modelled successfully； BMSCs transplantation therapy had a certain effect was proved by final pathology results and cirrhosis abated. Conclusion It is effective that autologous BMSCs transplantation treat liver cirrhosis， but basic research and a large sample of clinical data are still demanded.

Key wordsbone marrow mesenchymal stem cells； cirrhosis model； mice； transplant

［通讯作者简介］严祥，教授，E-mail：yanxiang528@sohu.com。

［第一作者简介］牛艳君（1989-），女，陕西延安人，硕士。

［基金项目］甘肃省科技重大专项项目（1302FKDA029）。

［收稿日期］2015-12-15

［中图分类号］R657.3+1

［文献标识码］A

DOI：10.11952/j.issn.1007-1954.2016.03.007