甘草酸、甘草苷对肿瘤细胞中硫氧还蛋白的核定位影响及其临床意义*

潘博宇，　王荷花，　张小骥，　黄　娟，　吴元欣，　陈孝平

武汉工程大学化工与制药学院绿色化工过程教育部重点实验室，武汉　430073



甘草酸、甘草苷对肿瘤细胞中硫氧还蛋白的核定位影响及其临床意义*

潘博宇，王荷花，张小骥，黄娟，吴元欣，陈孝平△

武汉工程大学化工与制药学院绿色化工过程教育部重点实验室，武汉430073

摘要：目的通过选用甘草的主要单药活性成分作用于人宫颈癌HeLa细胞，探索其对硫氧还蛋白(thioredoxin-1，Trx)在肿瘤细胞核中定位的影响。方法选取甘草酸(glycyrrhizic acid，GCA)、甘草苷(liquiritin，LQ)两种单药分别设置药物浓度梯度与作用时间梯度实验组。再将一定浓度的GCA、LQ分别与临床化疗药物紫杉醇(paclitaxel，PTX)或表柔比星(epirubicin，EPI)两两联用设置联合用药实验组。通过Western blot测定Trx在HeLa细胞核中表达量的变化，四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测药物对HeLa细胞增殖抑制的影响。结果Trx在细胞核内的含量变化均随2种单药浓度的增大和药物作用时间的延长呈下降趋势；GCA、LQ对细胞的毒性较小，且其与低剂量化疗药物联用对细胞核中Trx表达量的影响，与单纯高剂量化疗药物作用效果相近。结论GCA和LQ均可使Trx在HeLa细胞核中的表达下降，且其与临床化疗药物联用有望降低后者的使用剂量，从而表现出一定的潜在临床应用价值。

关键词：甘草酸；甘草苷；硫氧还蛋白；肿瘤细胞；核定位

硫氧还蛋白(thioredoxin-1，Trx)是一类分布比较广泛的小分子多功能蛋白，它在细胞凋亡及肿瘤细胞耐药方面扮演着重要的角色。目前针对多种肿瘤细胞系的相关实验研究发现，Trx表达含量与肿瘤细胞耐药方面存在某种正相关联系[1-2]，即癌症患者体内Trx表达水平较高，其往往会对多种临床抗癌药物呈现出一定的耐药性[3-4]。这主要是由于抗癌药物作用于肿瘤细胞后，会使较多的Trx向细胞核转移，从而使其能够维持还原状态，继而通过增强转录因子的活性保持细胞抗凋亡的特性[5-6]。因此Trx入核是肿瘤细胞产生耐药性的关键因素，而抑制其入核可以作为肿瘤临床治疗的一种有效策略。

甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)系多年生草本植物，是我国重要的传统中药材。甘草中的主要活性成分为皂苷类与黄酮类物质，代表物分别是甘草酸(glycyrrhizic acid，GCA)和甘草苷(liquiritin，LQ)[7]。相关研究表明甘草中的有效成分具有体外抗肿瘤的活性，它对凋亡相关蛋白有重要作用[8]，但目前国内外尚缺乏其对Trx作用的研究报道。本研究通过设置一系列药物实验组，探索了甘草的主要单药活性成分GCA和LQ对Trx在HeLa细胞核中的定位影响，旨在通过将低毒的中药有效成分与化疗药物进行联用，从而降低后者的使用剂量，以期达到与单纯高浓度化疗药物作用相近的效果，进而减轻患者的不良反应。

1材料与方法

1.1试剂与仪器

细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；兔源性抗Trx多克隆抗体、兔源性抗Histone-H3多克隆抗体、鼠源性抗β-actin单克隆抗体、过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)均购自武汉三鹰生物技术有限公司；甘草酸(GCA，上海源叶生物科技有限公司，纯度≥99%)；甘草苷(LQ，上海晶纯生化科技股份有限公司，纯度≥98%)；紫杉醇(PTX，海口市制药厂有限公司，5 mL 30 mg)；盐酸表柔比星(EPI，辉瑞制药无锡有限公司，5 mL 10 mg)。

主要仪器：CO2细胞培养箱(HF90/240型，力康生物医疗科技控股集团公司)；蛋白质电泳及转膜装置(Bio-Rad，美国)；高速冷冻离心机(HC-3018R型，安徽中科中佳科学仪器有限公司)；倒置生物显微镜(奥特光学仪器有限公司)；酶标测定仪(M2E/DE05665型，美谷分子仪器上海有限公司)。

1.2细胞培养

人宫颈癌传代细胞(HeLa)，由本实验室液氮储藏罐冷冻保藏。HeLa细胞用DMEM高糖培养液，内含10%胎牛血清、1%青-链霉素(青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL)双抗溶液，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

1.3实验分组

1.3.1Western blot检测分组①GCA/LQ用药：实验分组情况详见表1。②联合用药：将GCA和LQ分别与临床化疗药物PTX或EPI进行两两联用，并设置相同作用时间(20 h，即：单药先处理HeLa细胞10 h，再与化疗药物共处理10 h)，不同作用浓度(即：空白对照；高剂量化疗药物浓度A μg/mL；低剂量化疗药物浓度B μg/mL；低剂量化疗药物浓度B μg/mL+低剂量单药浓度200 μg/mL；低剂量化疗药物浓度B μg/mL+高剂量单药浓度600 μg/mL)。实验分组情况详见表2。

表1　GCA/LQ实验组分组情况

表2　联合用药实验组分组情况

1.3.2MTT比色法检测分组实验组将GCA和LQ分别与临床化疗药物PTX或EPI进行两两联用，并设置相同作用时间(20 h，即：单药先处理HeLa细胞10 h，再与化疗药物共处理10 h)，不同作用浓度(即：空白对照与溶媒阴性对照；高剂量单药浓度1 000 μg/mL；高剂量化疗药物浓度A μg/mL；低剂量化疗药物浓度B μg/mL +高剂量单药浓度1 000 μg/mL)。实验分组情况详见表3。

表3　MTT检测实验组分组情况

1.4Western blot法检测Trx表达含量

将通过抽提得到并经BCA蛋白浓度测定后的细胞核蛋白，进行SDS-凝胶电泳，保证每孔蛋白绝对含量一致。积层胶电泳时电压为60 V，进入分离胶时电压升至130 V。电泳结束后，根据预染Marker截取目的蛋白所在的凝胶片段。此后进行200 mA恒流转膜，洗膜封闭后，加入一抗4℃过夜。第2天洗膜后孵育二抗(37℃，1 h)，再洗膜30 min，进行ECL化学发光检测。细胞核蛋白以兔源性抗Histone-H3多克隆抗体的检测作为内参对照。

1.5MTT比色法检测细胞增殖抑制率

取对数生长期的HeLa细胞，以5.0×104个/mL的密度分别接种于96孔板中，而后按照表3中的分组进行实验。待作用于HeLa细胞20 h后(每个浓度点设7个复孔)，加入MTT工作液，孵育4 h后加入Formazan溶解液。至结晶完全溶解后，在酶标测定仪上测定570 nm波长下各孔的吸光度(A)值。计算各组细胞增殖抑制率[细胞增殖抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%]。

1.6统计学分析

应用SPSS 17.0软件对所获得的实验数据进行统计学处理，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1GCA/LQ对Trx在HeLa细胞核定位的影响

随着GCA、LQ浓度的增加，细胞核中Trx表达量均呈现依次减弱趋势；并且当2种单药浓度同为200 μg/mL时，胞核中Trx表达量与空白组相比，其入核的情况几乎被2种单药所抑制(图1)。另外，细胞核中Trx表达量亦随GCA或LQ作用时间的延长呈逐渐下降趋势(图2)。

1：空白对照组；2：GCA/LQ 100 μg/mL组；3：GCA/LQ 200 μg/mL组图1　Western blot检测不同浓度GCA/LQ对Trx核内表达影响Fig.1 Western blot analysis of the impact of different concentrations of GCA/LQ on Trx expression in the HeLa cell nuclei

1：空白对照组；2：GCA/LQ作用12 h组；3：GCA/LQ作用24 h组图2　Western blot检测不同作用时间下GCA/LQ对Trx核内表达影响Fig.2 Western blot analysis of the impact of different action time of GCA/LQ on Trx expression in the HeLa cell nuclei

2.2联合用药对Trx在HeLa细胞核定位的作用

2.2.1PTX与GCA/LQ联合用药当PTX浓度为60 μg/mL时，随着GCA、LQ浓度增加，细胞核中Trx表达均呈逐渐下降趋势；且当低剂量PTX(60 μg/mL)联合高剂量GCA或LQ(600 μg/mL)作用于HeLa细胞时，胞核中Trx的表达量，不仅较单纯低剂量PTX(60 μg/mL)用药组下降明显，而且与单纯高剂量PTX(120 μg/mL)用药组相比，也呈现下降或处于相近水平(图3)。

1：空白对照组；2：PTX高剂量组(120 μg/mL)；3：PTX低剂量组(60 μg/mL)；4：PTX低剂量组(60 μg/mL)+GCA/LQ低剂量组(200 μg/mL)；5：PTX低剂量组(60 μg/mL)+GCA/LQ高剂量组(600 μg/mL)图3　Western blot检测PTX联合用药实验组Trx核内表达Fig.3 Western blot analysis of the impact of PTX combination therapy on Trx expression in the HeLa cell nuclei

2.2.2EPI与GCA/LQ联合用药当EPI浓度为50 μg/mL时，随着GCA、LQ药物浓度增加，细胞核中Trx表达逐渐下降；且当低剂量EPI(50 μg/mL)与高剂量GCA或LQ(600 μg/mL)联合用药时，与单纯低剂量EPI(50 μg/mL)或单纯高剂量EPI(200 μg/mL)用药组相比，细胞核中Trx表达量均出现下降(图4)。

1：空白对照组；2：EPI高剂量组(200 μg/mL)；3：EPI低剂量组(50 μg/mL)；4：EPI低剂量组(50 μg/mL)+GCA/LQ低剂量组(200 μg/mL)；5：EPI低剂量组(50 μg/mL)+GCA/LQ高剂量组(600 μg/mL)图4　Western blot检测EPI联合用药实验组Trx核内表达Fig.4 Western blot analysis of the impact of EPI combination therapy on Trx expression in the HeLa cell nuclei

2.3联合用药对HeLa细胞增殖抑制作用

通过MTT法对联合用药实验进行检测，结果显示，GCA、LQ两种单药作用HeLa细胞20 h，分别与单纯高剂量化疗药物(PTX、EPI)和几种联合用药情况相比，都对细胞的抑制较少(①②之间无明显差异，P>0.05)，从而提示两种单药成分对于细胞的毒性相对较小。此外，几种联合用药对HeLa细胞的抑制情况与单纯高剂量化疗药物(PTX、EPI)作用结果相似(③④⑤之间亦无明显差异，P>0.05)。上述结果提示由于联合用药会使Trx在HeLa细胞核中的表达出现明显下降，因而在一定程度上降低了肿瘤细胞对化疗药物的耐受性(图5、6)。

①：GCA；②：LQ；③：单纯高剂量PTX；④：低剂量PTX与单药GCA联合；⑤：低剂量PTX与单药LQ联合图5　PTX联合实验对HeLa细胞增殖抑制率比较Fig.5 Effects of PTX combination therapy on cell proliferation rate

①：GCA；②：LQ；③：单纯高剂量EPI；④：低剂量EPI与单药GCA联合；⑤：低剂量EPI与单药LQ联合图6　EPI联合实验对HeLa细胞增殖抑制率比较Fig.6 Effects of EPI combination therapy on cell proliferation rate

3讨论

在正常人体血清中，Trx含量应维持在10～80 ng/mL之间。但通过对许多癌症患者血清检测发现，其体内Trx含量约为正常人的2倍甚至更高[9]。与此同时，免疫组织化学技术相关检测结果也表明，在多种恶性肿瘤组织或细胞中，Trx的表达也存在明显过量的问题[10]。由于Trx转位至细胞核会使多种肿瘤细胞系产生抗药现象[6，11]，因此Trx入核是肿瘤细胞产生耐药性的重要因素。寻找可抑制Trx核定位的药物并与临床化疗药物联合使用，则有望抑制肿瘤细胞的耐药性和加强肿瘤治疗的效果。

甘草药用的记录始于《神农本草经》，其具有低毒、较强的防癌抗癌生物活性特点和较高的药用价值。因此本实验旨在研究其主要活性成分对Trx在HeLa细胞核中的定位影响及其治疗应用方面的价值。GCA、LQ的分组实验结果表明，Trx在细胞核中的表达均随2种单药浓度的增大与药物作用时间的延长呈现下降趋势，从而提示2种单药可抑制Trx入核，但具体相关机制目前不详，有待进一步研究。此外，本研究还发现GCA、LQ对细胞的毒性较小，且它们分别与低剂量化疗药物联用能够显著抑制Trx在细胞核中的水平，对细胞生长的抑制率也可达到单纯高剂量化疗药物的效果。

综上所述，GCA与LQ同临床化疗药物联合使用，可以加强肿瘤治疗效果，其机制是GCA与LQ抑制了Trx在肿瘤细胞细胞核中的表达，从而降低了肿瘤细胞的耐药性。

参考文献

[1]Sun Y，Rigas B.The thioredoxin system mediates redox-induced cell death in human colon cancer cells：implications for the mechanism of action of anticancer agents[J].Cancer Res，2008，68(20)：8269-8277.

[2]Arai R J，Ogata F T，Batista W L，et al.Thioredoxin-1 promotes survival in cells exposed to S-nitrosoglutathione：Correlation with reduction of intracellular levels of nitrosothiols and up-regulation of the ERK1/2 MAP kinases[J].Toxicol Appl Pharmacol，2008，233(2)：227-237.

[3]Kim S J，Miyoshi Y，Taguchi T，et al.High thioredoxin expression is associated with resistance to docetaxel in primary breast cancer[J].Clin Cancer Res，2005，11(23)：8425-8430.

[4]Iwao K K，Matoba R，Ueno N，et al.Prediction of docetaxel response in human breast cancer by gene expression profiling[J].J Clin Oncol，2005，23(3)：422-431.

[5]Wei S J，Botero A，Hirota K，et al.Thioredoxin nuclear translocation and interaction with redox factor-1 activates the activator protein-1 transcription factor in response to ionizing radiation[J].Cancer Res，2000，60(23)：6688-6695.

[6]Shan W H，Zhong W X，Zhao R，et al.Thioredoxin-1 as a subcellular biomarker of redox imbalance in human prostate cancer progression[J].Free Radic Biol Med，2010，49(12)：2078-2087.

[7]杨式华，孔兰芬，董胜强，等.UPLC同时测定甘草及甘草浸膏中的甘草苷和甘草酸[J].中国实验方剂学杂志，2013，19(17)：157-160.

[8]商潇云，李鑫，于波，等.甘草提取物(GC-3)体外诱导HeLa细胞凋亡及机制研究[J].中华临床医师杂志，2013，7(23)：10798-10801.

[9]Burke-Gaffney A，Callister M E，Nakarnura H.Thioredoxin：friend or foe in human disease[J].Trends Pharmacol Sci，2005，26(8)：398-404.

[10]Powis G，Montfort W R.Properties and biological activities of thioredoxins[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol，2001，41(1)：261-295.

[11]Chen X P，Liu S，Tang W X，et al.Nuclear thioredoxin-1 is required to suppress cisplatin-mediated apoptosis of MCF-7 cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2007，361(2)：362-366.

(2015-04-02收稿)

Effects of Glycyrrhizic Acid and Liquiritin on the Thioredoxin Expression in the Nuclei of Tumor Cells

Pan Boyu，Wang Hehua，Zhang Xiaojietal

KeyLaboratoryforGreenChemicalProcessofMinistryofEducation，SchoolofChemicalEngineeringandPharmacy，WuhanInstituteofTechnology，Wuhan430073，China

AbstractObjectiveTo investigate the impact of active components of main single drugs from licorice on the expression of thioredoxin-1(Trx)in the nuclei of human cervical carcinoma HeLa cells.MethodsThe experimental groups were established according to the concentration gradient and different treatment time of glycyrrhizic acid(GCA)and liquiritin(LQ).Additionally，GCA and LQ at certain concentrations were separately combined with clinical chemotherapy drugs paclitaxel(PTX)or epirubicin(EPI)to set up the combined experimental groups.The changes of Trx expression levels in HeLa cell nuclei were measured by immunoblotting，and the effects of the drugs on cell proliferation were tested by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay.ResultsThe expression levels of Trx in the nuclei of HeLa cells were decreased in a dose- and time-dependent manner after treatment with GCA and LQ.Both GCA and LQ were found less toxic to cells.The effects of GCA and LQ combined with low-dose chemotherapy drugs on the expression levels of Trx were similar to those in high-dose chemotherapy drug groups.ConclusionGCA and LQ can decrease the Trx expression levels in HeLa cell nuclei.Their combination with clinical chemotherapy drugs are expected to reduce the dosage of chemotherapy drugs，which have great potential clinical application values.

Key wordsglycyrrhizic acid；liquiritin；thioredoxin-1；tumor cell；nuclear localization

中图分类号：R737.33

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.013

*国家自然科学基金资助项目(No.81172178)

潘博宇，男，1990年生，硕士研究生，E-mail:pbywhh@126.com

△通讯作者，Corresponding author, E-mail:chenxiaoping@mail.wit.edu.cn