丁苯酞对阿尔茨海默病大鼠海马p38丝裂原激活蛋白激酶和细胞外信号调节激酶表达的影响

齐凡星　胡　莹　刘　洁　康丽娟　张会朵

(保定市第一中心医院神经内二科，河北　保定　071000)



丁苯酞对阿尔茨海默病大鼠海马p38丝裂原激活蛋白激酶和细胞外信号调节激酶表达的影响

齐凡星胡莹1刘洁康丽娟张会朵

(保定市第一中心医院神经内二科，河北保定071000)

〔摘要〕目的探究丁苯酞对阿尔茨海默病(AD)大鼠海马区中p38丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)和细胞外信号调节激酶(ERK)表达的影响。方法雄性成年SD大鼠90只随机分为试验组、对照组和空白组各30只，在试验组和对照组大鼠海马区内注射Aβ1～42建立AD模型，建模后第2天开始给予试验组丁苯酞灌胃，对照组和空白组给予相同剂量的食用麻油，共喂养30 d。之后通过Y型迷宫比较三组学习记忆能力，通过免疫组织化学染色方法比较三组脑组织中p38MAPK和ERK的表达水平。结果三组学习记忆能力由强到弱依次为空白组，试验组和对照组；三组CA1海马区p38MAPK表达阳性的细胞数量由高到低依次为对照组、试验组和空白组；三组大脑皮层中ERK表达水平由高到低依次为空白组，试验组和对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论丁苯酞可明显改善AD大鼠的学习记忆能力，其原因可能与海马区p38MAPK表达下降及大脑皮层中ERD表达提高有关。

〔关键词〕丁苯酞；阿尔茨海默病；p38丝裂原激活蛋白酶(MAPK);细胞外信号调节激酶(ERK)

tau等蛋白过度磷酸化可导致大脑神经元纤维缠结，后者所占全部神经元的比例与阿尔茨海默病(AD)患者的症状呈正相关〔1〕。而包括p38在内的多种丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)及细胞外信号调节激酶(ERK)可通过调控tau等蛋白的磷酸化达到改善痴呆程度的目的〔2〕。丁苯酞具有降低tau蛋白磷酸化的功能〔3〕，本研究研究丁苯酞对AD模型大鼠海马p38MAPK和ERK表达的影响。

1资料与方法

1.1实验动物及分组北京大学医学院实验动物中心提供的雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠90只随机分为试验组、对照组和空白组各30只。所有SD大鼠均健康，试验组平均体质量(232.63±7.55)g，对照组(233.64±7.47)g，空白组(232.89±7.61)g，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2实验设备及试剂10%水合氯醛(青岛宇龙海藻有限公司/国药准字：p7022673)；Aβ1～42购自Sigma公司；丁苯酞(石药集团恩必普药业有限公司/国药准字：p0050298)；p38MAPK抗体、ERK抗体及相关染色试剂购自重庆威斯腾生物医药科技有限公司；全自动免疫组织化学染色仪MY2300购自澳大利亚郝思林公司。

1.3大鼠AD模型制备试验组和对照组腹腔注射10%水合氯醛麻醉，剂量0.5 ml/100 g。麻醉成功后定位大鼠双侧海马区，向其分别注射5 μl(1 μg/μl)Aβ1～42。

1.4试验过程及切片制备将丁苯酞与食用麻油按0.1 g/12.5 ml的比例混合配制成悬浊液。自建模第2天开始，给予试验组上述悬浊液灌胃治疗，剂量为75 mg/kg。给予对照组和空白组等容积的食用麻油灌胃，1次/d，共喂养30 d。30 d后，应用Y型电迷宫对学习记忆能力进行测定，具体为：让大鼠在Y型电迷宫内适应5 min后，人为选取一个安全区，当大鼠移动到非安全区时给予电击同时安全区灯亮，若大鼠未移动至安全区继续重复上述指令至大鼠移动至安全区。反复训练至仅在安全区灯亮，无电刺激时大鼠即移动至安全区，电迷宫试验停止〔4〕。之后给予所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，剂量1.0 ml/100 g。麻醉成功后，剖胸暴露心脏，自左心室灌注200 ml的0.9%生理盐水后继续灌注4%多聚甲醛。同时迅速切开颅骨取出脑组织，经固定、脱水、石蜡包埋后制得厚度约5 μm切片。

1.5免疫组织化学测定切片脱蜡处理后首先于75℃的枸橼酸钠溶液中浸泡15 min。之后用0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗15 min。再经20%过氧化氢室温浸泡10 min后用蒸馏水冲洗两次，每次15 min。滴加p38MAPK抗体(1∶300)和ERK抗体(1∶400)后于2℃环境下放置12 h，之后滴加染色试剂ABC后在配套显色盒下显色。

1.6观察指标①电迷宫试验停止时大鼠接受电刺激的次数；②于低倍镜和高倍镜下观察CA1海马区和皮质区内p38MAPK和ERK阳性细胞的数量：以染色呈红棕色作为判定细胞阳性的标准，每个区域取两张切片在高倍镜下计算其平均值作为最终阳性细胞的数量。

1.7统计学方法采用SPSS18.0统计软件进行t检验。

2结果

2.1三组学习记忆能力比较建模前对照组、试验组和空白组在Y型电迷宫试验中接受电刺激的次数〔(15.77±2.73)、(15.78±2.65)、(15.49±2.62)次〕差异无统计学意义(P>0.05)。治疗30 d后，三组接受电刺激的次数由多到少依次为对照组〔(23.78±4.75)次〕，试验组〔(18.31±2.73)次〕和空白组〔(15.98±2.67)次〕(P<0.05)，见表1。

2.2三组切片中p38MAPK和ERK表达情况比较在光学显微镜下观察，三组CA1海马区p38MAPK表达阳性的细胞数量由高到低依次为对照组(52.81±6.73)，试验组(38.69±7.32)和空白组(21.35±4.22)(图1)，差异有统计学意义(P<0.05)。三组大脑皮层中ERK表达水平由高到低依次为空白组(48.39±7.27)，试验组(32.75±5.38)和对照组(18.71±4.42)(图2)，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1　三组切片中p38MAPK表达情况

图2　三组切片中ERK表达情况

3讨论

大脑弥散性萎缩和神经细胞变性是AD的主要病理改变〔5，6〕。以p38为代表的MAPK及ERK在脑组织中表达的水平与痴呆的程度呈现明显的相关性〔7〕。慢性炎症反应造成的神经元不可逆变性被认为是AD形成的重要因素，而p38MAPK和ERK在促炎及抗炎的平衡中行使重要功能〔8〕。p38MAPK可通过介导炎症因子中的白细胞介素-1和肿瘤坏死因子-α生成，从而加重炎症反应，而后者又可通过促进小胶质细胞释放p38MAPK使其正反馈通路不断扩大〔9〕。此外，小胶质细胞本身可以释放其他炎症因子和超氧自由基，小胶质细胞的激活将炎症反应进一步放大，最终加速脑部神经元的不可逆变性。传统观点认为ERK信号通路主要与神经元的增殖、分化及损伤后的修复有关，但最新研究〔10〕发现许多分化成熟的神经元中仍有大量ERK及相应的靶蛋白存在，因此一部分学者〔11〕倾向于将ERK信号通路活跃视为神经元存活的指标。丁苯酞除此之外还具有降低tau蛋白磷酸化的效果〔12〕。

本试验提示丁苯酞在改善AD大鼠的认知功能上效果显著，与Peng等〔13〕的研究结论相一致。可推测Aβ1～42可通过介导p38MAPK的过表达触发炎症反应的正反馈通路，而丁苯酞抑制tau蛋白磷酸化的作用机制主要通过阻断p38MAPK过表达来实现。ERK的过表达对神经元起保护作用并参与了学习记忆形成的过程，而丁苯酞通过促进小胶质细胞分泌ERK从而达到延缓AD进程的目的。然而Aβ1～42所得AD大鼠模型与人神经元长期慢性炎症所致的不可逆变性仍存在较大差异〔14〕，将丁苯酞应用于AD患者仍需要更加深入研究。

4参考文献

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2张会凯，张晓炜，生晓娜，等.丁苯酞对阿尔茨海默病大鼠VEGF、P38MAPK表达的影响〔J〕.中国医师杂志,2013;15(9):1158-61.

3张会凯，张晓炜，王珊，等.丁苯酞对Aβ1-42致AD大鼠海马p38MAPK表达的影响〔J〕.中风与神经疾病杂志，2013;30(8)：681-4.

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8李秋霞，陈淅泠，王欣东，等.丁苯酞注射液对血管性痴呆大鼠海马区生长相关蛋白-43及突触素P38表达的影响〔J〕.实用医学杂志，2012;28(7)：1067-9.

9李自如，高彩云，袁军.丁苯酞治疗血管性认知功能障碍患者的临床疗效〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(3):606-8.

10侯德仁，田怡，周军，等.丁苯酚对阿尔兹海默病模型大鼠P38及ERK表达的影响及意义〔J〕.南方医科大学学报，2009；29(8)：1592-5.

11曹燕，王旭，梁枫.认知功能障碍相关信号通路〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(21)：6295-7.

12邵小鹏，桂树华，胡玲玲.丁苯酞治疗老年血管性痴呆的临床疗效及对精神心理量表的影响〔J〕.中国老年学杂志，2013;33(22)：5601-2.

13Peng Y,Xing C,Lemere CA,etal.1-3-n-Butylphthalide.ameliorates.beta-amyloid-induced neuronal toxicity in cultured neuronal cells〔J〕.Neurosci Lett,2008;434(2):224-9.

14Akiyama H,Barger S,Barnum S,etal.Inflammation and Alzheimer disease〔J〕.Neurobiol Aging,2000;21(3):383-421.

〔2014-11-25修回〕

(编辑苑云杰)

〔中图分类号〕R742

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)08-1834-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.019

基金项目：保定市科学研究与发展计划项目(No.20151643)

1保定市第一中心医院心内三科

第一作者：齐凡星(1982-)，男，硕士，主治医师，主要从事神经内科疾病研究。