蒙药嘎日迪乌日勒对脑缺血再灌注损伤的保护作用及对一氧化氮、一氧化氮合酶、脑源性神经营养因子、血管内皮生长因子的影响

巴图德力根　韩志强　王　茜　孙晓成　安　达

(内蒙古民族大学附属医院蒙药临床药理研究所,内蒙古　通辽　028007)



蒙药嘎日迪乌日勒对脑缺血再灌注损伤的保护作用及对一氧化氮、一氧化氮合酶、脑源性神经营养因子、血管内皮生长因子的影响

巴图德力根韩志强王茜1孙晓成2安达

(内蒙古民族大学附属医院蒙药临床药理研究所,内蒙古通辽028007)

〔摘要〕目的探讨蒙药嘎日迪乌日勒对脑缺血再灌注损伤的保护作用及对一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法SD大鼠分为假手术组、模型组、阳性组、嘎日迪乌日勒低、高剂量组，每组20只，10只用于脑梗死面积百分比测定,10只用于脑匀浆中NO、神经型一氧化氮合酶(nNOS)、VEGF及BDNF含量测定。嘎日迪乌日勒低、高剂量组分别给予灌胃嘎日迪乌日勒0.18、0.36 g/kg，阳性组给予金纳多片0.16 g/kg，1次/d,连续给药7 d。再灌注24 h后处死大鼠，取脑，进行TTC染色计算脑梗死面积，HE染色观察脑组织病理改变；制备10%的脑组织匀浆，检测NO、nNOS、VEGF及BDNF含量。结果与假手术组比较，其他组脑梗死面积明显升高(P<0.05)；与模型组比较，阳性组、嘎日迪乌日勒高、低剂量组脑梗死面积明显降低(P<0.05)。HE染色，给药组正常脑组织结构消失，椎体细胞体积缩小，部分椎体细胞脱失、坏死、组织稀疏，间质水肿，与梗死区边界模糊。与假手术组比较，模型组、嘎日迪乌日勒低、高剂量组NO、nNOS、BDNF、VEGF均明显升高(P<0.05)；阳性组NO、nNOS、VEGF明显升高(P<0.05)。与模型组比较，阳性组、嘎日迪乌日勒低、高剂量组NO、nNOS明显降低，嘎日迪乌日勒低剂量组BDNF明显升高、VEGF明显降低(P<0.05)。结论嘎日迪乌日勒对脑缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，其机制可能与调节脑组织中NO、nNOS、BDNF、VEGF的含量有关。

〔关键词〕嘎日迪乌日勒；脑缺血再灌注损伤

蒙药嘎日迪乌-13，蒙古名扎冲十三味丸，由诃子、制草乌、石菖蒲、木香、人工麝香、珊瑚(制)、珍珠(制)、丁香、肉豆蔻、沉香、禹粮土、磁石(煅)、甘草等药材组成；功能祛风通窍，舒筋活血，镇静安神，除“协日乌素”。用于半身不遂，左瘫右痪，口眼歪邪，四肢麻木，腰腿不利，言语不清，筋骨疼痛，神经麻痹，风湿，关节疼痛。收载于1998年版卫生部药品标准(蒙药分册)〔1〕。嘎日迪-13味丸在各蒙医医院和蒙药生产企业的制备工艺均有所不同。国家“十二五”支撑计划课题研究组查阅相关文献，并咨询蒙医医院临床医生、院内制剂室工艺专家，蒙药生产企业工程师，蒙医院校蒙药方剂、制剂、工程专家，最终达成共识，确定了最终制备工艺参数，命名为“嘎日迪乌日勒”。研究表明，嘎日迪-13味丸对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，机制可能与调节神经元特异性烯醇化酶(NSE)、白细胞介素(IL)-1 、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量有关〔2〕。本课题研究嘎日迪乌日勒对脑缺血再灌注损伤的保护作用及对一氧化氮(NO)、NO合酶(NOS)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)的影响，为蒙药嘎日迪乌日勒治疗 “萨病”提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要仪器XTS-4A型手术显微镜，江苏镇江中天光学仪器有限责任公司；AUW120D电子天平(0.000 01 g)，日本岛津制作所试验计测事业部；DW-GL218型低温冰箱，北京中科美菱低温科技有限责任公司；BG10-3A高速冷冻离心机，北京时代北利离心机有限公司；DY89-2电动玻璃匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司；Image-Pro Plus 6.0专业图像分析系统，美国Media Cybernetics公司；莱卡DM2500显微镜，德国莱卡。

1.1.2主要药品嘎日迪乌日勒：内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室；金纳多片：德国威玛舒培博士大药厂，每片含有银杏叶提取物40 mg，其中银杏黄酮苷9.6 mg，萜类内酯2.4 mg(银杏内酯、白果内酯)，批准文号：p0090296 Dr.Willmar Schwabe GmbH & Co.KG 86978378000147。

1.1.3试剂2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)试剂，北京拜尔迪生物技术有限公司。NO、NOS(nNOS)、VEGF、BDNF酶联免疫试剂盒，购自上海沪尚生物科技有限公司。

1.1.4实验动物SPF级健康雄性SD大鼠，体重200～220 g，由辽宁省长生生物技术有限责任公司提供，生产许可证号：SCXK(辽)-2010-0001。

1.2方法

1.2.1实验动物分组、给药、造模方法〔3〕SD大鼠，按体重随机分为假手术组、模型组、金纳多阳性组、嘎日迪乌日勒低、高剂量组，每组20只，10只用于脑梗死面积百分比测定,10只用于脑匀浆中NO、nNOS、VEGF及BDNF含量测定。嘎日迪乌日勒低、高剂量组，分别给予灌胃嘎日迪乌日勒0.18、0.36 g/kg，阳性组给予金纳多片0.16 g/kg，均按20 ml/kg体积灌胃给药，假手术组及模型组予等容积0.5%纤维素钠混悬液，1次/d,连续给药7 d。给药7 d后禁食、不禁水12 h，10%水合氯醛(3.0 ml/kg)腹腔注射麻醉，参照Longa等〔4〕的线栓法略加改良，制备大鼠大脑中动脉闭塞模型(MCAO)。对大鼠大脑中动脉闭塞模型进行神经功能缺失评分：0分，没有神经功能缺损，1分(不能完全伸展对侧前爪)为轻度局灶性神经功能缺损，2分(向对侧转圈)为中度的局灶性神经功能缺损,3分(向对侧倾倒)为重度的局灶性神经功能缺损，4分为大鼠没有自发地行走，并且意识丧失。达到1～3分者纳入研究。

1.2.2脑梗死面积百分比测定再灌注24 h后取各组存活大鼠麻醉(10%水合氯醛3.0 ml/kg)，抽出全身血液，快速断头取脑。将所取大鼠脑组织置于-20℃低温冰箱20 min，取出后由前向后迅速均匀切片(间隔约1.5～2 mm)，切片置于新配制的含1%TTC的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)中，37℃避光置于恒温水箱10 min(隔5 min翻动脑片1次，以确保染色均匀)，在10%中性甲醛溶液中固定。用数码相机双面拍摄染色后脑片，传输至计算机，运用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析系统分析脑梗死面积百分比。

1.2.3脑组织匀浆的制作及脑匀浆中NO、nNOS、VEGF及BDNF含量测定再灌注24 h后取各组存活大鼠麻醉(10%水合氯醛3.0 ml/kg)，抽出全身血液，快速进行断头取脑，冰PBS冲洗，除去血液后在手术显微镜下去掉脑膜及血管，在冷PBS中漂洗，滤纸拭干，在大脑中动脉缺血梗死区及缺血梗死区周围半暗带区取脑组织，用预冷的0.1 mmol/L pH7.4 PBS，制成10%脑组织匀浆,4℃，3 000 r/min离心8 min收集上清液，分装后放于-80℃保存备用。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测脑组织匀浆中NO、nNOS、VEGF及BDNF含量。

1.3统计学方法应用SPSS17.0软件行多组方差分析。

2结果

2.1脑梗死面积百分比测定结果与假手术组(0)比较，其他组脑梗死面积明显升高(P<0.05)。与模型组(0.26±0.017)比较，阳性组(0.21±0.027)、嘎日迪乌日勒高、低剂量组(0.20±0.030)、(0.21±0.047)脑梗死面积明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2脑组织匀浆中NO、nNOS、VEGF及BDNF含量测定与假手术组比较，模型组、嘎日迪乌日勒低、高剂量组NO、nNOS、BDNF、VEGF含量均明显升高(P<0.05)；阳性组NO、nNOS、VEGF明显升高(P<0.05)。与模型组比较，阳性组、嘎日迪乌日勒低、高剂量组NO、nNOS明显降低，嘎日迪乌日勒低剂量组BDNF明显升高、VEGF明显降低(P<0.05)。见表1。

表1各组脑组织NO、nNOS、BDNF、VEGF含量比较表(x±s，n=10)

组别NO(μmol/L)nNOS(ng/ml)BDNF(ng/ml)VEGF(ng/L)假手术组14.87±5.632.06±0.641.49±0.47294.16±101.18模型组53.15±5.081)3.68±0.151)1.60±0.461)528.76±58.771)阳性组43.75±12.151)2)3.35±0.411)2)1.57±0.60499.56±68.271)嘎日迪乌日勒低剂量组43.90±11.091)2)3.28±0.481)2)2.01±0.281)2)454.31±78.571)2)嘎日迪乌日勒高剂量组41.73±14.931)2)3.32±0.341)2)1.94±0.251)453.15±75.161)2)

与假手术组比较：1)P<0.05，与模型组比较：2)P<0.05

2.3脑组织苏木素-伊红(HE)染色结果假手术组HE染色可见神经元、胶质细胞及毛细血管形态正常，结构完整，包膜核膜清晰，椎体细胞核大而圆，核仁明显。模型组可见明显梗死灶，正常脑组织结构消失，椎体细胞体积缩小，细胞质嗜伊红，细胞核呈三角形固缩浓染，部分椎体细胞脱失、坏死、组织稀疏，间质水肿，较多炎性细胞改变的神经元和形态正常的神经元交错存在，主要位于基底节内侧及额顶叶皮质的上部，与梗死区边界清楚。给药组与模型组相比梗死灶面积相对较小，正常脑组织结构消失，椎体细胞体积缩小，部分椎体细胞脱失、坏死、组织稀疏，间质水肿，与梗死区边界模糊。见图2。

A：假手术组；B：模型组；C：阳性组；D：嘎日迪乌日勒低剂量组；E：嘎日迪乌日勒高剂量组；下图同图1　脑组织切片TTC染色

图2　脑组织病理切片HE染色

3讨论

本实验结果表明，嘎日迪乌日勒能明显降低脑缺血再灌注后脑梗死面积。在脑缺血再灌注损伤中，NO可能扮演着双重角色，即神经保护和神经毒性，生理量的NO具有保护作用，而高浓度则有明显的神经毒性〔5〕，nNOS可能介导了再灌注后早期神经元损伤〔6〕。本研究表明嘎日迪乌日勒对脑缺血再灌注损伤的保护作用可能与降低 nNOS和NO有关。

VEGF可被缺氧所诱导〔7〕，而在脑梗死时，脑水肿的形成先于血管生成〔8〕。Kovacs等〔9〕研究发现，早期阶段(18 h～2 d)梗死边缘和核心的巨噬细胞成为VEGF的第一个主要来源，而神经元的VEGF从损伤后的18 h～5 d在核心区，并且至10 d在边缘区可被检测到。虽然VEGF对损伤后脑组织的血管再生及神经保护有一定的作用，然而VEGF增加血管通透性的作用又可能是加重脑缺血再灌注损伤后引起脑水肿的一个重要原因。对于脑组织来说，脑水肿可能是致命的并发症，因脑组织广泛的水肿可能会引起颅内压增高形成脑疝而危及生命。本实验也进一步验证了VEGF可被缺氧所诱导，嘎日迪乌日勒可通过降低血管通透性，减轻脑缺血再灌注损伤。

BDNF主要存在于中枢神经系统，其作用广泛，包括抗凋亡、调节局部炎症，保护大脑对抗缺血损伤、抗TMT诱导的神经毒性、在体外增加神经的形成；在体内可促进暂时性脑缺血损伤模型的脑恢复〔10〕等功能。本研究表明嘎日迪乌日勒低剂量组能够明显升高脑组织中BDNF含量，而起到保护脑缺血再灌注损伤的作用。

综上所述，嘎日迪乌日勒对脑缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，其机制可能与调节脑组织中NO、nNOS、BDNF、VEGF的含量有关。

4参考文献

1中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准(蒙药分册)〔S〕.1998:70.

2陶春,林琳,宋葆华,等.蒙药嘎日迪-13味丸对脑缺血大鼠海马组织白介素-1β、肿瘤坏死因子-α蛋白及神经细胞凋亡的影响〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(1):152-4.

3田彩云,张浩楠,何静波,等.嘎日迪-13对局灶性脑缺血大鼠NSE、TNF-α、IL-6表达的影响〔J〕.中草药,2015;46(5):716-20.

4Longa EZ,Weinstein PR,Carlon S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats 〔J〕.Stroke,1989;20(1):84-91.

5Calabrese V,Mancuso C,Calrani M,etal.Nitric oxide in the central nervous system:neuroprotection versus neurotoxicity 〔J〕.Nat Rev Neurosci,2007;8(10):766-75.

6Samdani AF,Dawson TM,Dawson VL,etal.Nitric oxide synthase in models of focal ischemia 〔J〕.Stroke,1997;28(6):1283-8.

7Mukhopadhyay D,Tsiokas L,Zhou XM,etal.Hypoxic induction of human vascular endothelial growth factor expression through c-Src activation〔J〕.Nature,1995;375(6532):577-81.

8Liu HM.Neovasculature and blood-brain barrier in ischemic brain infarct 〔J〕.Acta Neuropathol,1988;75(4):422-6.

9Kovacs Z,Ikezaki K,Samoto K,etal.VEGF and flt:expression time kinetics in rat brain infarct 〔J〕.Stroke,1996;27(10):1865-72.

10Zhu JM,Zhao YY,Chen SD,etal.Functional recovery after transplantation of neural stem cells modified by brain-derived neurotrophic factor in rats with cerebral ischaemia〔J〕.J Int Med Res,2011;39(2):488-98.

〔2015-12-11修回〕

(编辑袁左鸣)

Protective effects of traditional Mongolian medicine Ga-Ri-Di-Wu-Ri-Le on cerebral ischemia-reperfusion and influences on the levels of NO,NOS,BDNF and VEGF

Ba Tu-de-li-gen，HAN Zhi-Qiang,WANG Qian，et al.

Institute of Clinical Pharmacology of Traditional Mongolian Medicine,Affiliated Hospital of Inner Mongolia University for the Nationalities,Tongliao 028007,Inner Mongolia Autonomous Region,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the protective effects of traditional Mongolian medicine on cerebral ischemia-reperfusion and influences on the levels of NO,NOS,BDNF,VEGF.MethodsThe SD rats were divided into sham,model,Ginaton,Ga-Ri-Di-Wu-Ri-Le low and high dose groups.10 rats were used to evaluate infraction area percentage,10 rats were used to detect the levels of NO,nNOS,VEGF and BDNF of brain tissue homogenize.ResultsThe infraction area of sham group was significantly increased compared with that of other groups(P<0.05);compared with that of model group,the infraction areas of Ginaton,Ga-Ri-Di-Wu-Ri-Le high and low dose groups were significantly decreased(P<0.05).The normal histological structures of drug treated groups were disappeared,the volume of pyramidal cells were reduced,same pyramidal cells were dropped out or necrotized,the tissues were sparse and interstitial edema were observed,the edges of infraction area were blurred,the pathological changes were significantly milder than those of model group.Compared with those of sham group,the levels of NO,NOS,BDNF,VEGF in model,Ga-Ri-Di-Wu-Ri-Le low and high dose groups were significantly increased(P<0.05);NO,NOS,VEGF contents of Ginaton group were significantly increased(P<0.05).Compared with those of model group,the NO,NOS contents of Ginaton,Ga-Ri-Di-Wu-Ri-Le low and high dose groups were significantly decreased(P<0.05),the BDNF and VEGF contents of Ga-Ri-Di-Wu-Ri-Le low dose group were significantly increased(P<0.05).ConclusionsThe Ga-Ri-Di-Wu-Ri-Le has significant protective effects on cerebral ischemia-reperfusion injury,its mechanism might related with regulation of levels of NO,nNOS,BDNF,VEGF of brain tissues.

【Key words】Traditional Mongolian medicine Ga-Ri-Di-Wu-Ri-Le;Cerebral ischemia-reperfusion injury

〔中图分类号〕R74

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)08-1792-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.002

基金项目：国家科技支撑计划基金资助项目(No.2012BAI27B02)

1通辽市人民医院

2内蒙古民族大学临床医学院

第一作者：巴图德力根(1969-)，男，硕士，教授，硕士生导师，主要从事蒙药药理研究。