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非双原核胚胎利用价值的探讨

2016-06-01易晓芳席红琳罗伟詹玲

保健文汇 2016年4期
关键词:卵裂原核体外受精

●易晓芳 席红琳 罗伟 詹玲

非双原核胚胎利用价值的探讨

●易晓芳 席红琳 罗伟 詹玲

目的:分析来源非双原核胚胎在体外受精-胚胎移植周期中的利用价值。方法:回顾性分析接受常规体外授精-胚胎移植助孕患者2698个新鲜周期,比较来源双原核胚胎(2PN-E)与无原核胚胎(0PN-E)及单元核胚胎(1PN-E)的卵裂率、胚胎利用率、妊娠率,并随访其妊娠结局。结果:1、2PN胚胎与0PN、1PN胚胎卵裂率为97.8%VS28.3%VS92.1%(p值<0.0001), 0PN胚胎卵裂率远远低于正常2PN胚胎及1PN胚胎;2、2PN胚胎与0PN、1PN胚胎卵裂胚胎的胚胎利用率为64.9%VS23.4%VS25.7%(p值<0.0001), 0PN、1PN胚胎利用率也低于正常2PN胚胎;3、新鲜移植2PN胚胎与0PN、1PN胚胎妊娠率为35. 7%VS13.6%VS 0%,(p值<0.05), 0PN胚胎妊娠率低于正常2PN胚胎,但具有一定的妊娠率,而且移植周期中部分包含0PN胚胎患者移植妊娠率妊娠率为37.9%,比正常纯2PN胚胎移植患者稍高(p值>0.05),无统计学差异性;1PN胚胎妊娠率为0,而且移植周期中部分包含1PN胚胎患者移植妊娠率妊娠率为23.8%,比正常纯2PN胚胎移植患者低(p值<0.05),有统计学差异性;4、其中3例纯0PN-E移植妊娠患者均成功分娩健康婴儿。结论:在 IVF-ET 治疗周期中,对于 2PN-E 极少或无 2PN-E 的周期,0PN-E 可考虑进行胚胎移植,1PN胚胎相对利用价值低。

体外受精-胚胎移植;未见原核胚胎(0PN-E);妊娠率;胚胎发育潜能

体外受精-胚胎移植(in-vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)技术迄今已发展近40年,如今,随着二胎政策的放开,如何提高不孕不育症患者尤其是高龄患者胚胎利用率,为其提供更多的妊娠机会,是辅助生殖技术领域的重要研究课题之一。卵母细胞在授精 16-20h 后观察有无2 个原核(pronucleus,PN ),是判定胚胎是否正常受精的重要依据,但有些周期中含有非双原核胚胎,即未见原核来源的胚胎(0PN-E )及单元核胚胎(1PN-E),即授精16-20h未观察到原核或单元核,但胚胎第二天发生分裂,有文献报道[1],在IV F-ET 周期中,约有 30~ 40% 的卵子在镜下观察表现为未见原核,这部分胚胎能否用于移植、如何选择尚存争议。国外已有来源非双原核的胚胎移植获得妊娠的文献报道[2],国内也有相关报道。本文通过比较来源2原核胚胎(2PN-E)组与0PN-E组、1PN-E组卵裂率、胚胎利用率、妊娠率,以期评价非双原核卵裂期胚胎的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2011年1月~2015年12月在本中心行 IVF周期患者2698例,其中新鲜周期移植全部为2PN-E 周期1921例,部分0PN-E周期65例,全部0PN-E周期22例,部分1PN-E周期42例,全部1PN-E周期5例。

1.2 方法

①控制性超促排卵及取卵

采用本生殖中心常规超促排卵方案,当主导卵泡中有以下情况之一时: 1 个直径达 18 mm; 2 个直径达 17 mm; 3 个直径达 16 mm,肌注人绒毛膜促性腺激素(hu-man chorionic gonadotrophin,HCG )5 000~ 10 000U,36 h 后在阴道 B 超引导下行穿刺取卵术。

②精液处理、受精、卵裂及胚胎观察

常规体外受精:患者丈夫于取卵当日手淫取出精子,密度梯度离心法+上游法处理后,调精子密度约至2-3万条精子/卵。一般于取卵后2~5 h,常规方法体外受精,受精后 17~ 19 h 观察受精情况。第 2 天或第 3 天观察胚胎时记录卵裂球的数目、有无碎片及形态是否对称。

③移植胚胎的选择

第三天胚胎评分标准为 :Ⅰ级 :卵裂球数 6~ 10 个,卵裂球等大均匀,碎片 <10% ;Ⅱ级 :卵裂球数 7~ 9 个,卵裂球等大均匀,碎片10%~ 25% ;Ⅲ级 :卵裂球大小不均匀,碎片 25%~ 50% ;Ⅳ级 :卵裂球大小均匀或不均匀,碎片>50% ;其中Ⅰ~Ⅲ级为可利用胚胎予以移植。

④临床妊娠的确认

选择胚胎进行宫腔内移植,移植 28-35d 后在 B 超下进行监测,见到孕囊者为临床妊娠,移植后予以黄体酮或地屈孕酮支持黄体功能。

2 结果

2.1 实验室结果

常规IVF周期2698周期,获卵总数24497枚,其中2PN为16000个,0PN为5285个,1PN为763个。2PN胚胎卵裂率为97.8%,胚胎利用率64.9%,0PN胚胎卵裂率为28.3%,胚胎利用率23.4%,1PN胚胎卵裂率为92.1%,胚胎利用率25.7%(表1)。

2.2 妊娠结局

新鲜周期移植全部为2PN-E 周期1921例,部分0PN-E周期65例,全部0PN-E周期22例,部分1PN-E周期42例,全部1PN-E周期5例。新鲜移植2PN胚胎与0PN、1PN胚胎妊娠率为35. 7%VS13.6%VS 0% (p值<0.05),移植胚胎部分包含0PN-E妊娠率46.2%,移植胚胎部分包含1PN-E妊娠率23.8%(表2),其中3例纯0PN-E移植妊娠患者均成功分娩健康婴儿(表3)。

表1 2PN胚胎与0PN胚胎卵裂率、胚胎利用率的比较

表2 2PN胚胎移植与0PN胚胎移植组妊娠结局的比较

表3 移植全部0PN胚胎妊娠患者结局随访

3 讨论

3.1 0PN-E 的可能形成机制及利用价值

一般情况下,0PN 的可能形成机制有以下几个方面 :1、未受精,2、已受精,但若原核形成延迟,原核在授精后20 h尚未出现或是由于原核提前融合而16小时早消失,则在原核观察时间(授精后 16~ 20 h )观察为0PN,3、没有在合适的时间(授精后 16~ 20 h)去观察胚胎。因此来源 0PN 的卵裂期胚胎在这些情况均可能出现:①未受精 :虽然未受精,但因为某些理化因素的刺激,导致卵母细胞孤雌激活,恢复并完成第二次减数分裂,发生卵裂从而形成胚胎[3];或者双雌胚胎,表现为未见原核及单个极体(1PB),其形成机制可能是未分裂出来的第二极体参与到核遗传物质的形成,Munne S 等通过 FISH和多态标志分析发现 4个 O PN l个极体(PB)胚胎中 2 个为二倍体双雌胚胎[4]。②正常受精 :受精卵为正常受精,但由于原核消失早或观察时间晚未观察到原核,但有些正常受精胚胎存在非整倍体异常 :国内有文献报道[5],采用微阵列-比较基因组杂交(microarray-CG H )染色体分析对 4 个 0PN 胚胎进行检测,均呈非整倍性变异。③各种异常受精 :如多精受精、精子染色体解聚异常、雌性原核形成异常等,由于原核消失早或观察时间晚未观察到原核。

从0PN-E 的可能形成机制中,可以看到部分0PN-E来源正常受精胚胎,理论上这类胚胎是可以利用的。本研究中0PN胚胎卵裂率为28.3%,胚胎利用率23.4%,全部0PN-E周期新鲜移植妊娠率13.6%,移植胚胎部分包含0PN-E妊娠率46.2%,说明全部或部分移植 0PN-E 不影响妊娠结局,而且,对于只有0PN-E的患者,可以提供妊娠机会。马水英,陈子江等[6]研究了3938个IVF 周期中,2PN 来源胚胎的囊胚形成率与 0PN比较,无显著差异(P>0. 05),2 种受精卵来源的优质囊胚在冻融周期的临床妊娠率无显著差异2PN,55. 6 %, OPN55. 1% (P>0. 05)。

全部移植 0PN-E 或部分移植 0PN-E 的周期中,均有健康婴儿出生,充分说明 0PN-E 可以在宫腔内种植并且发育成健康胎儿。由此,在无2PN-E 或 2PN-E 极少的情况下,优质 0PN-E 可以作为备选胚胎进行移植。这一结论与国外报道的结论相一致[2][7][8]。

国内邹林兵,戴志俊等人[9]研究了IVF-ET治疗中,21个完全来源0PN的卵裂期胚胎新鲜移植周期,临床妊娠6例(9胎),其中3例活产(3男2女),2例流产(3胎),1例异位妊娠.此外,李明 , 乔杰 等[10]研究了101 例新鲜移植完全来源于0PN 胚胎中, 99 例移植分裂期 胚 胎,临床妊娠率为:9.09%(9/99),着床率:7.09%(9/127);妊娠结局:1例胎停育,2例继续, 6个健康婴儿出生。移植囊胚2 例,没有妊娠。这些研究都表明在无其它可选胚胎的特殊情况下,0PN-E移植具有一定的移植价值。

3.2 1PN-E 的可能形成机制及利用价值

卵子的孤雌激活、雌原核或雄原核形成异常及融合、雌雄原核发育不同步是产生1PN-E的可能原因。在IVF中,卵子的成熟度并不相同,非成熟的卵子在与精子结合后,即使精子进入卵子,但是精子核不能发生解聚,形成不了雄原核,随着卵子的体外继续培养并成熟,卵子经过激活后已经发生了皮质反应,雌原核形成,却不能形成雄原核,即孤雌激活,从而形成单元核胚胎,即1PN-E 。若 1PN-E是由观察前发生了原核融合,那么这类胚胎经过卵裂后还是具有正常核型的,理论上是具有利用价值的。

3.3 非双原核来源胚胎安全性

虽然研究结果表明0PN来源胚胎具有一定利用价值,但是毕竟从发生机制上来看,0PN-E可能来自孤雌激活或异常受精胚胎,若此类胚胎植入,将会导致严重后果。国外Soeda S等[11]研究发现,0PN来源胚胎中,18、X、Y 染色体核型异常率较高,且性染色体单体及三体的情况比较普遍若此类胎儿诞生,极有可能出现畸形等严重后果。

国内一些研究,如石洁 等[12]利用荧光原位杂交(fluorescent in-situ hybridization,FISH)技术对未见到原核的 MII 卵发育来的胚胎和低形态评分的 2PN 胚胎进行性染色体及 18 号染色体非整倍体分析,结果前者染色体异常率为 47. 5%,后者染色体异常率为 48. 5%,二者胚胎染色体异常率相近,甚至0PN-E稍低于低形态评分的 2PN 胚胎。进一步证明在胚胎数少的情况下,相比低形态评分的2PN 胚胎,优质 0PN-E 可以作为备选移植胚胎。章师平,曹云霞等[13]通过荧光原位杂交技术,检测体外受精周期中非二原核来源胚胎的性染色体倍性,移植周期中 0PN-E的单倍体率、二倍体率、多倍体率以及嵌合体率分别为7.1 4 %、5 3.5 7%、2 5%和 1 4.2 9%,1PN-E的单倍体率、二倍体率、多倍体率以及嵌合体率分别为 50%、40%、0和 10 %。也就是说,在非双原核胚胎中,正常二倍体胚胎还是占多数,移植相对安全度上升。也有研究显示[14]IVF-1PN来源的胚胎中50% 左右为二倍体,一半合子中有Y染色体。

针对孤雌激活胚胎,国内有针对小鼠进行研究[15],利用不同电脉冲参数和激活液对小鼠卵母细胞进行活化,结果发现电激活孤雌胚体外发育时序比正常胚胎慢,但囊胚细胞数与对照组差异不显著。它们经胚胎移植后,其中的一部分能够着床,但着床率仅为3.6% ,极显著低于对照组(67%,P<0. 01),也就是说如果0PN-E来源于孤雌激活胚胎,则绝大部分会着床失败。本研究中0PN-E胚胎具有一定妊娠率,并分娩正常胎儿,但1PN-E胚胎结局差,部分含1PN-E并不能提高妊娠率,纯1PN-E移植组无一妊娠,提示1PN-E利用价值可能较低,但由于本研究中,纯1PN-E移植组仅5人,例数少,无统计学差异。

对于非双原核胚胎,经过体外囊胚培养,一旦形成囊胚,其正常核型的比例非常高[16],再结合胚胎植入前遗传学诊断技术,从中筛选出正常的胚胎进行移植,进一步从技术上提供安全保证。

综上可见,在无 2PN-E 或 2PN-E 数极少的 IVF 周期中,移植优质0PN-E 在理论上是可行的,能够增加IVF 周期的利用率,减轻患者经济压力和心理压力。本中心已有患者全部移植 0PN-E 并分娩外观正常婴儿,说明在无 2PN-E 或 2PN-E 极少的情况下,0PN-E 可作为备选移植胚胎。虽然部分或全部移植 0PN-E 可获正常妊娠,但其移植的伦理性、安全性仍需要深度探讨,如何能从0PN-E中挑选出正常受精胚胎将值得进一步研究。针对1PN-E,由于本中心例数所限,结果提示妊娠结局差,需要更大数据进一步分析。

(作者单位:湖北省宜昌市三峡大学仁和医院)

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