响应面法优选雷公藤超声提取工艺
2016-06-01徐晓勇马凤森方剑乔吴小娟
徐晓勇， 马凤森，*， 方剑乔， 梁 宜， 吴小娟
（1.浙江工业大学药学院，浙江杭州310014；2.浙江中医药大学附属第三医院，浙江杭州310009）
响应面法优选雷公藤超声提取工艺
徐晓勇1， 马凤森1，2*， 方剑乔2， 梁宜2， 吴小娟1
（1.浙江工业大学药学院，浙江杭州310014；2.浙江中医药大学附属第三医院，浙江杭州310009）
摘要：目的 优化雷公藤TriPterygium wifordii Hook.f.的超声提取工艺。方法 以总三萜和去甲泽拉木醛为指标，以超声功率、粉碎粒度、提取时间为影响因素，采用响应面法优化雷公藤的超声提取工艺。结果 最优工艺参数为超声功率400 W、粉碎粒度30目，提取时间40 min。总三萜和去甲泽拉木醛提取率分别为（1.282±0.025）％和（0.518±0.006）％。结论 该方法简单有效，具有实际意义。
关键词：雷公藤；总三萜；去甲泽拉木醛；超声提取；响应面法
雷公藤（TriPterygium wilfordii Hook.f.）为卫矛科藤本植物，具有祛风活络，破淤止痛等功效。现代研究表明，其有抗免疫、抗炎、抗生育及抗肿瘤等作用［1］，临床常用于类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的治疗［2-3］。
由于雷公藤毒性大，成分复杂，故药材提取以单一成分为指标时，难以保证其质量。雷公藤全根中主要含生物碱、二萜、三萜、倍半萜及多糖［4］等成分，毒性大小依次为二萜、生物碱、三萜［5］。其中，雷公藤三萜类成分已被证明具有明显的药理作用，而且雷公藤红素、去甲泽拉木醛与二萜雷公藤甲素有着显著的抗免疫活性［3-6］，但雷公藤红素和雷公藤甲素存在毒副作用过大、致突变性较强的缺陷［7-8］，而去甲泽拉木醛的含有量高，毒性较小，其LD50值为1 295 mg/kg［9］。因此，本实验在前期研究［10］的基础上，选择去甲泽拉木醛和总三萜作为雷公藤提取工艺的指标，进行多指标的质量控制。
首先，应用单因素试验法考察了药材产地、药材部位、提取方法、提取溶剂、粉碎粒度、提取时间、料液比、提取功率、提取次数对雷公藤有效成分提取率的影响。结合文献［11］与实验结果，选择对结果影响较大的提取功率、粉碎粒度、提取时间3个因素进行响应面设计试验。然后，采用Box-Benhnken法［12］对超声提取［13］雷公藤全根药材的最佳工艺条件进行研究。
1 仪器与试剂
Waters高效液相色谱仪（515-717-486，美国Waters公司）；UV-1600PC紫外-可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；JY92-Ⅱ细胞破碎仪（宁波新芝生物科技有限公司）；PT-1004/205电子天平（福州华志科学仪器有限公司）；FW177中药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。
雷公藤根采自浙江省景宁县，经浙江中医药大学附属第三医院药剂科专家鉴定为卫矛科雷公藤属植物雷公藤TriPterygium wilfordii Hook.f.的全根，批号为20130314。去甲泽拉木醛纯品购自南通飞宇生物技术有限公司，批号FY18540803，含有量99.35％。高效液相所用试剂为色谱纯；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 雷公藤有效成分的提取工艺 取干燥雷公藤全根，粉碎，精密称取药材粉末10 g，加入10倍量乙酸乙酯，超声提取一定时间，抽滤，弃去滤渣，测量并记录滤液体积，即得药材提取液。
2.2 去甲泽拉木醛的含有量测定
2.2.1 色谱条件［14］Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长245 nm；流动相乙腈-0.1％磷酸水溶液（55∶45）；柱温室温；体积流量1.0 mL/min。
2.2.2 溶液的制备
2.2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取去甲泽拉木醛对照品适量，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含去甲泽拉木醛21.35 μg/mL的溶液。
2.2.2.2 供试品溶液的制备 取雷公藤乙酸乙酯提取液适量，70℃下挥干，甲醇溶解并定容至5 mL，过滤，即得。
2.2.3 专属性试验 取对照品和供试品溶液适量，分别注入HPLC色谱仪中测定，结果见图1，可知供试品溶液中去甲泽拉木醛的分离度大于1.5。
1.去甲泽拉木醛1.demethylzeylasteral图1 HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms
2.2.4 精密度试验 取对照品溶液适量，在“2.2.1”项色谱条件下连续进样6次，测得峰面积RSD为0.18％，表明仪器精密度良好。
2.2.5 回收率试验 精密吸取6份等量雷公藤提取液（约含去甲泽拉木醛17 mg），稀释后加入等量的对照品溶液，混合均匀，在“2.2.1”项色谱条件下进样，测得回收率为95.8％，RSD 为1.63％。
2.2.6 重复性试验 取同一份雷公藤提取液适量，按“2.2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，测得RSD为1.55％，表明该方法重复性良好。
2.2.7 标准曲线的制备 取不同体积的对照品溶液注入HPLC色谱仪，在“2.2.1”项色谱条件下测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得回归方程Y=1 200.9X-0.089 4，r=0.999 7，在0.1～1.3 μg范围内线性关系良好。
2.2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液适量，分别于0、2、4、6、8、10 h注入液相色谱仪，测得RSD为1.20％，表明溶液在10 h内稳定性良好。
2.3 总三萜的含有量测定 参考文献［10］中的紫外分光光度法，其原理是利用三萜在无水条件下与强酸反应，形成阳碳离子盐的显色反应。取雷公藤提取液适量，70℃下挥干，加入5％香兰素-冰醋酸溶液0.5 mL、高氯酸1.8 mL，摇匀，70℃水浴加热反应15 min，取出，置于冰水浴中冷却5 min，冰醋酸定容至5 mL，摇匀。以空白对照溶液为参比，测定其在530 nm波长处的吸光度。
2.4 响应面优化雷公藤提取工艺研究 在单因素试验的基础上，选择超声功率（A）、粉碎粒度（B）、提取时间（C）作为考察因素进行响应面设计，因素水平见表1，结果见表2。
表1 因素水平Tab.1 Factors and levels
表2 响应面试验结果Tab.2 Results of response surface experiments
3 响应面结果分析
3.1 模型与数据分析 由于去甲泽拉木醛为雷公藤三萜中的木栓烷型成分，故与总三萜的提取行为具有一定的相似性。Pearson相关系数分析发现，两者提取率（Y）的相关系数r为0.923，具有显著性关系。
应用Design-Expert8.0.5软件进行二次多元回归拟合，得到去甲泽拉木醛的回归方程为Y= 5.22 +0.14A +1.25B +0.16C +0.025AB -0.098AC+0.13BC+0.19 A2-2.12B2-0.11C2，总三萜的回归方程为Y=9.79 -0.14A+2.65 B+ 0.79 C+0.30AB+0.35AC+0.57BC+0.70 A2-3.48 B2+0.33C2。方差分析和显著性检验结果见表3和表4。
表3 去甲泽拉木醛方差分析Tab.3 Analysis of variance for demethylzeylasteral
表4 总三萜方差分析Tab.4 Analysis of variance for total triterpenoids
由表可知，整体模型的的p值均小于0.05，表明其效果显著；相关系数r分别为0.982 7、0.948 4，表明该模型与实际拟合较好，误差较小，可对雷公藤中去甲泽拉木醛和总三萜的提取工艺进行分析和预测。另外，粉碎粒度对雷公藤有效成分提取的影响最显著，其次为提取时间和超声功率。二次项中B2的偏回归系数达到非常显著的水平，而交互项AB、AC、BC均不显著。
3.2 响应面分析与优化 利用Design Expert软件，得到去甲泽拉木醛和总三萜的响应曲面，见图2和图3，发现两者在提取行为上一致。由图可知，合适的药材粉碎粒度对提取率有着非常显著的影响，在0.5 mm左右时提取率最高，但粒度过大时将明显下降。另外，超声功率和提取时间对两者的提取也有一定影响，高水平的2个因素能获得更高的提取率。
3.3 最佳制备工艺验证 由于去甲泽拉木醛和总三萜均具有药理活性，并且提取行为一致，故在进行工艺优化时，设定两者同等的权重。采用Design-Expert软件，结合实际操作情况，得到最佳提取工艺为超声功率400 W，粉碎粒度30目，提取时间40 min。然后，进行3次平行验证实验，测得去甲泽拉木醛和总三萜的提取率分别为（0.518± 0.006）％和（1.282±0.025）％，与两者的预测值（0.567％和1.231％）较为接近。由此表明，该方程与实际情况拟合度良好，适用于回归分析和参数优化。
图2 去甲泽拉木醛提取率的响应面曲线图Fig.2 Response surface curves for the extraction rate of demethylzeylasteral
图3 雷公藤总三萜提取率的响应面曲线图Fig.3 Response surface curves for the extraction rate of total triterpenes
4 讨论
由于中药制剂成分复杂，其疗效往往是多成分、多靶点、多效应综合作用的结果。因此，本实验选择去甲泽拉木醛与总三萜作为雷公藤有效成分的提取指标。目前，去甲泽拉木醛的提取方法主要为冷浸法［11］，而超声提取在节省提取溶剂、时间，提高提取率的方面更具有优势。
在单因素试验中，考察了乙酸乙酯、丙酮、不同体积分数和pH的乙醇溶液，发现提取率依次为乙酸乙酯>丙酮>95％乙醇>80％乙醇> 60％乙醇。推测其原因，可能是去甲泽拉木醛和总三萜的脂溶性较强，易溶于乙酸乙酯，但由于其渗透力不强，故导致粒径是提取率的重要影响因素。
由响应面曲线图可知，粉碎粒度对提取率影响显著，结合实验操作情况，选择过30目药材颗粒作为工艺条件，取得了良好的效果。超声提取药材中的有效成分主要依赖其空化效应及各种次效应，有学者提出超声提取药物成分的缩核模型［15］。即颗粒内部的“核”在超声作用下不断溶解缩小，并向外扩散。如果粉碎粒度过大，则药材总提取率主要由核界面层细胞的破坏速率决定，故减小药材粒径有利于其提取；当粉碎粒度过小时，浸取的控制步骤不是核-壳界面细胞的破碎，而是有效成分由界面穿过壳层的扩散，引起紧密堆积，导致局部有效浓度过大，从而降低提取率。
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［质 量］
Optim izing ultrasonic-assisted extraction of TriPterygium wilfordii by response surfacemethod
XU Xiao-yong1， MA Feng-sen1，2*， FANG Jian-qiao2， LIANG Yi2， WU Xiao-juan1
（1.College of pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China；2.The Third HosPital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310009，China）
ABSTRACT：AIM To optimize the ultrasonic-assisted extraction of TriPterygium wifordii Hook.f..METHODS With total triterpenes and demethylzeylasteral as indices，aswell as influencing factors including ultrasonic power，grinded particle size and extraction time，the ultrasonic-assisted extraction of T.wifordii was optimized by response surfacemethod.RESULTS The optimized parameters were 400 W for ultrasonic power，30 mush for grinded particle size and 80 min for extraction time.The extraction rates of total triterpenes and demethylzeylasteral were（1.282±0.025）％and（0.518±0.006）％，respectively.CONCLUSION This simple and effective method holds its practical significance
KEY WORDS：TriPterygium wifordii Hook.f.；total triterpenoids；demethylzeylasteral；ultrasonic-assisted extraction；response surfacemethod
*通信作者：马凤森（1962—），男，教授，从事药物新剂型研究。Tel：（0571）88871500，E-mail：merrigen@126.com
作者简介：徐晓勇（1991—），男，硕士生，从事药物制剂新技术研究。Tel：15068857772，E-mail：xuxiaoyongjq@163.com
基金项目：浙江省重大科技专项重点社会发展项目（2010C13014）；浙江省“重中之重”学科（针灸推拿学）开放基金项目（ZTK2010A13）
收稿日期：2015-08-03
doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.013
中图分类号：R284.2
文献标志码：A
文章编号：1001-1528（2016）05-1030-05
