麻黄-桂枝药对中桂枝对麻黄碱诱导兴奋性变化的抑制作用

郑芳昊， 罗佳波

（1.佛山市中医院，广东佛山528000；2.南方医科大学中医药学院，广东广州510515）



麻黄-桂枝药对中桂枝对麻黄碱诱导兴奋性变化的抑制作用

郑芳昊1， 罗佳波2*

（1.佛山市中医院，广东佛山528000；2.南方医科大学中医药学院，广东广州510515）

摘要：目的 采用药动学-药效学（PK-PD）模型拟合法考察麻黄-桂枝药对配伍中桂枝对麻黄碱诱导的兴奋性变化的抑制作用。方法 SD大鼠分别灌胃给予生理盐水、麻黄碱、麻黄和麻黄-桂枝药对（3∶2）水煎液。借助微透析采样技术，以麻黄碱在脑脊液中的质量浓度变化为PK观察指标，以氨基酸类神经递质谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）的动态变化为PD指标。结果 最佳药效动力学模型为Sigmoid-Emax模型。各组Glu的药物浓度-效应（E-C）曲线均呈顺时针环，各组GABA的E-C曲线均呈逆时针环。结论 麻黄碱易于产生耐受性，桂枝可以抑制麻黄碱引起的兴奋性变化。

关键词：麻黄；桂枝；药对；药动学-药效学（PK-PD）；谷氨酸（Glu）；γ-氨基丁酸（GABA）；药物浓度-效应（E-C）曲线；大鼠

麻黄汤是中医治疗风寒表实证的经典方剂，在临床中应用广泛。其中，麻黄和桂枝是发挥药效的主要药味，在原方中的配伍比例为3∶2。大量的实验研究表明，麻黄-桂枝配伍可以增强药物的发汗作用，缓解患者的发热、鼻塞、咳喘等症状［1-5］。然而，由于麻黄碱对中枢神经系统和心血管系统的毒副作用，西方国家将麻黄列为有毒的天然植物添加剂［6-10］。较低剂量下，麻黄可以改变大鼠的行为学参数，出现兴奋性行为变化。而在较高剂量下，长期给予麻黄将出现严重的不良反应，提示长期大剂量使用麻黄可能影响脑部特定区域神经细胞的正常结构和生理功能［11］。

PK-PD（pharmacokinetics-pharmacodynamics）模型（药动学和药效学结合模型），是在传统药动学和药效学的基础上发展而来的。通过测定特定效应的药物浓度和药理效应随时间的变化，有助于了解两者之间的内在联系。相对于传统的药动学研究，PK-PD模型要求尽量了解药物在体内作用部位的动力学特征，明确药物在作用部位的浓度变化，以此与药理效应更紧密的联系在一起，定量的反应药物浓度与效应的关系。通常PK-PD模型可以通过特定的数学模型进行拟合，通过比较参数的变化进一步掌握药物在作用部位的综合特性［12］。

本实验以麻黄碱在大鼠脑脊液中的质量浓度变化为药动学观察指标（PK），以氨基酸类神经递质谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）的动态变化为药效学指标（PD），阐明麻黄碱在大鼠额叶皮层的浓度-效应-时间三维关系，拟合药物浓度及其效应经时过程的曲线，为揭示麻黄-桂枝药对配伍的减毒机理提供科学依据。

1 材料

1.1 药材 麻黄为麻黄科植物草麻黄EPhedra sinica Stapf的干燥草质茎，产地吉林，批号110901；桂枝为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presel的干燥嫩枝，产地广西，批号121001，均购自广州致信中药饮片有限公司，经南方医科大学中药鉴定教研室马骥教授鉴定为正品。

1.2 试剂 盐酸麻黄碱对照品（批号060307，赤峰艾克制药科技有限公司）。乙腈、甲醇购自德国默克公司，均为色谱纯；氯化钠、氯化钙、氯化钾，均为市售分析纯。

1.3 仪器与耗材 微透析系统（RWD302，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；探针（CMA20，瑞典CMA/Microdialysis AB公司）；高效液相色谱仪（Agilent1200 Series，美国安捷伦科技有限公司）；液质联用仪（Agilent 6410 Triple Quad LC/MS，美国安捷伦科技有限公司）。

1.4 动物及分组 SD大鼠，雄性，24只，体质量180～220 g，SPF级，购于南方医科大学实验动物中心，动物合格证号SCXK（粤）2011-0015。采用随机方法将动物分组，每组6只，分别灌胃给予生理盐水、麻黄碱、麻黄和麻黄-桂枝药对（3∶2）水煎液。

2 方法

2.1 药液的制备

2.1.1 麻黄碱组 精密称取麻黄碱对照品，加蒸馏水制成4.80 mg/mL的溶液，作为麻黄碱组试液。

2.1.2 麻黄组 称取麻黄药材，按麻黄汤原方配比加10倍量水，浸泡30 min。煎煮20 min，去沫。再煎30 min，定容。浓缩至1.50 g/mL，按麻黄碱计为4.80 mg/mL，作为麻黄组试液。

2.1.3 麻黄-桂枝（3∶2）组 称取麻黄药材，按麻黄汤原方配比加10倍量水，浸泡30 min。煎煮20 min，去沫。按麻黄汤原方配比加桂枝药材，煎煮30 min，定容。按麻黄量计浓缩至1.85 g/mL，按麻黄碱计为4.80 mg/mL，作为麻黄-桂枝（3∶2）组试液。

2.1.4 林格氏液的配制 分别称取4.300 0 g氯化钠、0.122 1 g氯化钙、0.149 0 g氯化钾，加蒸馏水溶解，转移至500 mL量瓶中，加稀盐酸调pH 至7.4，定容，0.45 μL滤膜过滤，制得空白林格氏液溶液。

2.2 微透析法收集脑脊液 采用20％乌拉坦（0.6 mL/100 g）麻醉大鼠，插入胃管，固定于大鼠脑立体定位仪上，暴露颅骨。参照《大鼠脑立体定位图谱》，在前囟前2.6 mm、旁开1.3 mm、硬膜下3.6 mm颅骨上钻孔，插入脑探针。以1.5 μL/min灌注空白人工脑脊液（林格氏液），平衡2 h。分别灌胃给予各组试药（1 mL/100 g），采用动物低温收集器收集透析液样品，-80℃保存待测。实验结束后，对大鼠进行心脏灌注，分离取出鼠脑，福尔马林浸泡固定后，通过切片确定探针所在位置是否准确。若脑内损伤过重或探针膜头弯曲，摒弃实验结果［13］。以1∶1比例混合待测透析液和内标溶液后，立即进行LC-MS（液质联用）分析［14］。

2.3 PK-PD联合模型分析 采用Winnonlin 4.0.1软件，分别输入时间、药代动力学指标（药物浓度随时间的变化）、药效动力学指标（Glu、GABA含有量随时间的变化）3组数据，选用线性模型、对数模型及Sigmoid-Emax模型等PK-PD模型进行拟合。根据软件计算得到的R（相关系数）、AIC （Akaike信息量准则）、SBC（Schwarz信息量准则）等指标选择最佳药效动力学模型，比较不同给药组间的参数差异。

3 结果

3.1 麻黄碱在额叶皮层部位的药时曲线及Glu和GABA的水平变化 结果表明，不同组别麻黄碱在大鼠额叶皮层的药代动力学过程基本一致。与生理盐水组相比，不同组别的Glu、GABA均有不同程度的升高。其中，Glu均在60 min达到峰值，随着时间推移逐渐下降；麻黄碱组GABA质量浓度在100 min达到峰值，麻黄组和配伍组均在120 min达到峰值，随着时间推移逐渐下降。见图1～3。

图1　麻黄碱药-时曲线Fig.1 Concentration-time curves of ephedrine

图2　Glu质量浓度随时间变化曲线Fig.2 Curves of Glu concentration w ith time

图3　GABA质量浓度随时间变化曲线Fig.3 Curves of GABA concentration w ith time

3.2 PK-PD模型分析

3.2.1 不同PK-PD模型拟合的结果 如表1所示，通过PK-PD模型拟合，麻黄碱药效指标的最佳药效动力学（PD）模型为Sigmoid-Emax模型，各组AIC、SBC值相对较小，且相关系数较其它模型更接近1。其公式如下。

表1　药对对麻黄碱PD模型拟合参数的影响Tab.1 Effects of herb pair on PD fitting parameters of ephedrine

其中，E为即时效应值，Emax为最大效应，E0为基础效应值，ECe50为引起效应达到最大效应一半时的药物浓度值，C为药物即时浓度值，S为形状因子，反映曲线的形状变化。

3.2.2 药对配伍对Sigmoid-Emax模型拟合参数的影响 从表2的结果可以看出，麻黄碱组和麻黄组的Glu达峰质量浓度（Emax）均大于配伍组，而ECe50值小于配伍组，说明桂枝的加入抑制了麻黄碱引起的兴奋性变化。各组GABA的S值均大于1，说明此时S形曲线的中间部分较陡；而Glu的S值均小于1，说明低质量浓度时曲线较陡，但离开ECe50后，其曲线较平坦，效应接近Emax较慢。

3.2.3 PK-PD模型拟合的E-C曲线 实验结果如图4所示，以麻黄碱在大鼠脑脊液中的质量浓度变化为PK指标，以氨基酸类神经递质含有量的动态变化为PD指标，各组Glu的E-C曲线均呈顺时针环，说明各组大鼠给予麻黄碱后均出现了显著的快速耐受性；各组GABA的E-C曲线均呈逆时针环，说明抑制性氨基酸含有量变化滞后于血药浓度变化。

4 讨论

传统的药代动力学（PK）和药效动力学（PD）研究是分别进行的。其中，药代动力学研究多是通过测定体内血液的药物浓度变化来反应药物在体内的综合作用特征，无法反应作用部位的特定药动学特征。而药效动力学研究则主要在离体水平进行，相关模型往往呈现药物浓度和效应一一对应的关系，无法反应药物在体内的真实效应变化。实际上，PK和PD是在体内密切相关的两个同时进行的动力学过程。前者反应药物浓度随时间的变化规律，进而可以推断药物的吸收、分布、代谢和排泄特征。后者描述药理效应随时间的变化特征，进而推断作用部位的药物浓度与药理效应之间的变化规律。因此，有必要将两者结合起来同步研究。

麻黄碱是麻黄的主要药效成分，同时也是麻黄产生兴奋性毒副作用的毒性成分。由于麻黄碱分子量较小，因此可以直接通过血脑屏障进入脑区。谷氨酸（Glu）是兴奋性氨基酸类神经递质，而γ-氨基丁酸（GABA）是抑制性氨基酸类神经递质，两者的含有量变化可以直接反应动物的中枢神经系统变化。有实验研究表明，麻黄碱可以引起大鼠脑部氨基酸类神经递质变化，额叶皮层是影响最大的部位［15］。本实验采用的脑部微透析采样技术，可以同时收集反应药物浓度变化和效应变化的样品，进一步通过LC-MS/MS等灵敏度较高的分析技术可以测定样品中微量的麻黄碱和Glu、GABA等效应指标。

目前，常用的PK-PD模型有线性模型、对数线性模型、最大效应模型（Emax）、Sigmoid-Emax模型等。其中，Sigmoid-Emax模型是在研究中使用最多的药效模型，适用于描述多种药物在体内的浓度和效应关系。实验结果表明，以麻黄碱在大鼠脑透析液中的质量浓度变化为PK指标，以氨基酸类神经递质含有量的动态变化为PD指标，经模型拟合比较符合Sigmoid-Emax模型。PK-PD模型的药物浓度-效应曲线（E-C曲线）大致可分为3种类型，E-C S形曲线、E-C逆时针滞后曲线和E-C顺时针曲线。本实验研究表明，以大鼠脑透析液中麻黄碱的质量浓度变化为PK指标，以Glu含有量的动态变化为PD指标，给药后各组E-C曲线均呈顺时针，相对于药物浓度上升期的效应变化，同一药物浓度在下降期内所对应的效应显著减弱，说明各组动物均对麻黄碱产生了快速耐受性。以大鼠脑透析液中麻黄碱的质量浓度变化为PK指标，以GABA含有量的动态变化为PD指标，给药后各组E-C曲线均呈逆时针，相对于达到药物浓度峰值的时间，药理效应的峰值显著滞后，表明引起GABA含有量变化的效应室不在额叶皮层，麻黄碱并不是直接对GABA产生作用，而很有可能是机体对Glu含有量升高的自我调节作用。麻黄-桂枝配伍组与麻黄碱组和麻黄组相比，产生同一效应值药物浓度较高，说明桂枝对中枢神经的作用与麻黄碱相反，具有下调Glu水平和升高GABA水平的作用。

本实验通过PK-PD模型拟合，说明以麻黄碱在大鼠脑透析液中的质量浓度变化为PK指标，以Glu、GABA含有量的动态变化为PD指标，最佳PK-PD模型为Sigmoid-Emax模型。E-C曲线表明麻黄碱易于产生耐受性，桂枝可以抑制麻黄碱引起的兴奋性变化，这可能是麻黄-桂枝药对配伍后相对安全的证明。

参考文献：

［1］ 徐文杰，方 芳，余林中，等.麻黄桂枝药对解热作用及其机制的实验研究［J］.时珍国医国药，2013，24（7）：1547-1549.

［2］ 刘国清，罗佳波.麻黄汤不同配伍对大鼠发汗作用的影响［J］.中药新药与临床药理，2005，16（5）：318-320.

［3］ 朱秋双，任春清，刘 蕾，等.麻黄汤不同配伍解热药效实验研究［J］.黑龙江医药科学，2005，28（2）：12-13.

［4］ 刘永刚，罗佳波，贺 丰.麻黄汤及拆方抗炎作用的研究［J］.中药材，2005，28（5）：413-415.

［5］ 朱秋双，刘 蕾，任春清，等.麻黄汤配伍解热药效实验研究［J］.黑龙江医药科学，2004，27（5）：13-14.

［6］ Haller C A，Benowitz N L.Adverse cardiovascular and central nervous system events associated with dietary supplements containing ephedra alkaloids［J］.N Engl J Med，2000，343 （25）：1833-1838.

［7］ Singh A，Rajeev A G，Dohrmann M L.Cardiomyopathy associated with ephedra-containing nutritional supplements［J］. Congest Heart Fail，2008，14（2）：89-90.

［8］ Maglione M，Miotto K，IguchiM，et al.Psychiatric effects of ephedra use：an analysis of Food and Drug Administration reports of adverse events［J］.Am J psychiatry，2005，162（1）：189-191.

［9］ Miller S C.Psychiatric effects ofephedra：addiction［J］.Am J psychiatry，2005，162（11）：2198.

［10］ 陆 斌.麻黄或与其它兴奋剂合用易致严重不良反应［J］.药物不良反应杂志，2002，4（4）：275-276.

［11］ 郑芳昊，罗佳波.麻黄对大鼠中枢神经系统毒副作用的研究［J］.时珍国医国药，2015，26（3）：534-536.

［12］ 曹 岗，张 云，丛晓东，等.PK-PD模型在中药药动学中的应用［J］.中草药，2009，40（11）：1830-1834.

［13］ 陈 燕.麻杏石甘方药效/毒两性成分及脑内分布的研究［D］.广州：南方医科大学，2011.

［14］ 陈 燕，王有志，安春志，等.LC-ESI-MS/MS测定大鼠海马和纹状体中氨基酸类神经递质的含量［J］.今日药学，2013，23（2）：65-69.

［15］ 张秀明.麻杏石甘方药效/毒两性成分存效减毒整合机制研究—中枢神经系统［D］.广州：南方医科大学，2010.

［临 床］

Neuroprotective effect of Cinnamomi Ramulus against ephedrine-induced excitotoxicity in EPhedrae Herba-Cinnamomi Ramulus herb pair

ZHENG Fang-hao1， LUO Jia-bo2*
（1.Foshan MuniciPal HosPital of Traditional ChineseMedicine，Foshan 528000，China；2.School of Traditional ChineseMedicine，Southern Medical U-niversity，Guangzhou 510515，China）

ABSTRACT：AIM To study the neuroprotective effect of CinnamomiRamulus against ephedrine-induced excitotoxicity in EPhedrae Herba-CinnamomiRamulus herb pair by pharmacokinetics-pharmacodynamics（PK-PD）modeling.METHODS SD rats received gavage with saline，ephedrine，ephedra and EPhedrae Herba-Cinnamomi Ramulus herb pair（3∶2）decoctions.In themicrodialysis，the change of ephedrine concentration in cerebrospinal fluid was taken as a PK index，while the dynamic changes of amino acid neurotransmitterswere taken as PD indexes.RESULTS The best PK-PD modelwas Sigmoid-Emax.Each group of Glu E-C curve showed a clockwise loop，while E-C curve of GABA showed a counterclockwise loop.CONCLUSION Ephedrine has tachyphylaxis，and the excitatory changes induced by ephedrine can be inhibited by Cinnamomi Ramulus.

KEY WORDS：EPhedrae Herba；Cinnamomi Ramulus；herb pair；pharmacokinetics-pharmacodynamics（PKPD）；Glu；GABA；effect-concentration（E-C）curve；rats

*通信作者：罗佳波（1947—），男，教授，从事中药新药研发方向研究。Tel：（020）62789112，E-mail：ljb@fimmu.com

作者简介：郑芳昊（1987—），男，博士，从事中药新药研发工作。Tel：（0757）81092010，E-mail：fanghao-zheng@foxmail.com

基金项目：国家自然科学基金重点项目（81030066）

收稿日期：2015-10-21

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.005

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2016）05-0984-05