肝内胆管细胞癌相关成纤维细胞的分离、纯化及鉴定

杨柳晓， 高　强

1.复旦大学附属中山医院重症医学科, 上海　200032 2.复旦大学附属中山医院肝外科, 上海　200032



·论著·

肝内胆管细胞癌相关成纤维细胞的分离、纯化及鉴定

杨柳晓1， 高强2*

1.复旦大学附属中山医院重症医学科, 上海200032 2.复旦大学附属中山医院肝外科, 上海200032

[摘要]目的： 探讨肝内胆管癌相关成纤维细胞(iCAFs)的分离、纯化和鉴定方法，为后续研究奠定基础。方法： 在无菌条件下，留取肝内胆管细胞癌(iCCA)组织标本，充分剪碎后置入含Ⅳ型胶原酶和透明质酸酶的消化液中恒温振荡，将所得的单细胞悬液进行免疫磁珠分选纯化，分离出肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)并培养。通过观察细胞形态，并经免疫荧光和流式细胞仪测定，鉴定其是否为iCAFs。结果： iCAFs呈长条形或纺锤形，胞质透明，折光明显，胞核单个、呈圆形或卵圆形, 细胞突起相互交错重叠形成网格状排列、密集时呈现 “峰-谷”样表现；免疫荧光检测显示，α平滑肌肌动蛋白(+)、波形蛋白(+)、复合型角蛋白抗体(-)；流式细胞仪检测示，α平滑肌肌动蛋白(+)，同时CD34和CD45均为(-)。结论： 酶消化法联合免疫磁珠分选可有效分离出高纯度的iCAFs，为进一步研究iCAFs的相关功能研究提供了良好的平台。

[关键词]肝内胆管细胞癌；肿瘤相关成纤维细胞；分离；鉴定

肿瘤微环境中的成纤维细胞被活化后可以通过自分泌和(或)旁分泌途径为上皮提供促癌信号、参与肿瘤血管的形成，促进肿瘤侵袭转移[1]。这类具有特殊表型及功能、存在于肿瘤间质中的成纤维细胞群即被称为肿瘤相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)。研究[2]证实，CAFs的聚集和活化可以影响多种实体肿瘤的发生、发展及侵袭。肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, iCCA)是一种具有丰富间质成分的原发性肝癌，其肿瘤间质中富含的CAFs与肝内胆管细胞癌的发生发展密切相关[3]。为能进一步研究iCCA相关成纤维细胞(iCAFS)的生物学特性和影响肿瘤的机制，原代iCAFs的分离纯化和培养扩增是必要的。目前国内外对CAFs的分离主要采用组织块贴壁法和酶消化法。本研究采用酶消化法联合免疫磁珠分选进行原代iCAFs的分离、纯化及培养，证实具有可重复性及高纯度获得iCAFs的优势，有助于后续实验的进行，现报告如下。

1材料与方法

1.1主要仪器及试剂Ⅳ型胶原酶购自美国Invitrogen公司、透明质酸酶和牛血清蛋白(BSA)购自美国Sigma公司；胎牛血清(FBS)、高糖DMEM培养液、0.25%胰蛋白酶、双抗(青霉素、链霉素100 mg/L)、1×磷酸盐缓冲液(PBS)等购自美国Gibco公司；免疫组化及免疫荧光抗体α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)、复合型角蛋白抗体(pan-CK)购自英国Abcam公司，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和二抗购自上海碧云天生物技术有限公司；流式细胞实验用α-SMA-FITC、CD34-PE和CD45-APC抗体购自美国R&D公司；免疫磁珠分选仪及anti-fibroblast MicroBeads试剂盒(130050601)购自德国美天旎生物技术有限公司。

1.2标本来源及采集用于原代分离的肿瘤标本来自iCCA根治性切除的患者。在标本手术切除离体后15 min内，用无菌手术刀片切取体积大于1 cm3的组织块，尽量选取活性好、典型的肿瘤区域，避开坏死、出血区域及血管，置于含DMEM+1%双抗的50 mL离心管内，于4℃条件转移至实验室。

1.3细胞分离及纯化

1.3.1细胞酶消化法分离在超净台中，用含有双抗的PBS液反复漂洗癌组织标本多次，以去除血细胞；待冲洗液清亮后，用眼科剪修剪掉其他组织及肉眼可见的血管结构；用无菌手术刀片及眼科剪机械法将组织块尽量剪碎至<1 mm3，置于预先配制好的消化液(DMEM+0.1%BSA+1%双抗+500 U/mL Ⅳ型胶原酶+100 U/mL透明质酸酶，用0.22 μm孔径一次性无菌抽滤器过滤除菌)中，注意将组织完全浸没，于37℃恒温振荡仪内振荡30 min(200 次/min)。消化后经过400目筛网过滤，将滤液离心(800×g, 5 min)以分离上皮细胞和成纤维细胞,弃去沉淀的细胞团，将含有成纤维细胞的上清悬液再离心(100×g，10 min)，得到的沉淀细胞团用DMEM反复漂洗2～3次，重悬再离心(300×g，10 min)后进行免疫磁珠分选。

1.3.2细胞免疫磁珠分选纯化将分离所得细胞计数后,以每107个重悬于80 μL分选缓冲液中，加入20 μL的anti-fibroblast磁珠抗体,充分混合后避光置于室温(19～25℃)孵化30 min。用1～2 mL的分选缓冲液重悬后再离心(300×g，10 min)，所得细胞团重悬于500 μL的分选缓冲液中，按照免疫磁珠分选说明书，使用免疫磁珠分选器及LS柱进行阳性细胞的分选纯化。纯化后的细胞用培养液(DMEM+10%FBS+1%双抗)重悬后置于25 mL培养瓶，常规培养、传代。

1.4细胞鉴定

1.4.1形态学观察使用倒置相差显微镜每日观察细胞的贴壁情况，贴壁后的生长状况及形态变化。

1.4.2免疫荧光检测将已消毒的24 mm×24 mm盖玻片置于细胞培养六孔板的培养孔中，按1×105个/mL的细胞密度将细胞接种于培养孔中进行细胞爬片，2 d后进行免疫荧光鉴定。除去培养液，用PBS(1 mL/孔)漂洗3次(每次5 min)；加入1 mL 4%多聚甲醛(用PBS配制)，室温固定30 min，PBS洗3次(每次5 min)；加入0.5% TritonX-100(用PBS配制)室温孵育20 min，PBS洗3次(每次5 min)；加入5%山羊血清室温封闭30 min，去除血清，加一抗(α-SMA、vimentin、pan-CK)，4℃过夜，PBS洗3次(每次5 min)；加荧光二抗(1∶1 000)室温反应30 min，PBS洗3次(每次5 min)；DIPA染核，加荧光封片液封片，于荧光显微镜下观察。

1.4.3流式细胞仪检测将分离培养的细胞制备成1×106个/mL的悬液，加入1 mL破膜固定液于4℃遮光孵育30～60 min，离心重悬，经BSA封闭后加入流式抗体(α-SMA-FITC、CD34-PE、CD45-APC及同型对照)混匀，于4℃冰箱孵育20～30 min后，混匀离心弃上清，重悬后上机检测。

2结果

2.1细胞形态及传代将分离的细胞接种于25 mL培养瓶1～2 h后即可见贴壁，初始贴壁细胞常为圆形；24～48 h后逐渐伸展成长条形，胞膜同时形成多个大小不一的突起，胞质透明，折光明显，胞核单个、呈圆形或卵圆形(图1A)；此后这些突起不断向周边延伸扩展，并相互交错重叠形成网格状排列(图1B)；当细胞铺满培养瓶时，显微镜下呈现典型的“峰-谷”样表现(图1C)。初代培养需每2～3 d更换培养液，通常经过1周左右即可传代；第3代以后细胞增殖迅速，3～4 d即可传代。细胞所能传的代数受供体个体差异影响较大。

图1　显微镜下iCAFs的形态A：生长第2天的iCAFs(100×)；B： 生长第10天的iCAFs (100×)；C：生长第10天的iCAFs (40×)

2.2细胞免疫荧光染色特点将分离的细胞进行免疫荧光染色，由图2可见，细胞形态如前所述，pan-CK染色阴性，排除其上皮来源的可能性；而α-SMA和vimentin染色强阳性，高倍镜下可见细胞质内条索状纤维组织染色均匀，胞核清晰完整。Vimentin染色阳性通常提示细胞来源于间叶组织，而α-SMA是CAFs的特征性标志物。

2.3流式细胞仪鉴定结果用流式细胞仪检测分离培养的细胞α-SMA、 CD34、 CD45的表达情况。细胞主要表现为α-SMA(+)、同时CD34(-)和CD45(-)的特征。以同型对照为参照，α-SMA阳性表达的细胞达99.1%，提示其成纤维细胞的特征；而CD34和CD45基本不表达，证明其不是来源于内皮和(或)髓源性细胞系(图3)。

图2　iCAFs免疫荧光染色的结果

图3　iCAFs流式细胞检测结果A：设门圈定检测的iCAFs细胞，FSC为前向角度散射，SSC为侧向角散射；B：iCAFs表现为α-SMA(+)CD45(-)；C：iCAFs表现为α-SMA(+)CD34(-)

3讨论

3.1CAFs分离纯化的方法CAFs是肿瘤微环境重要的组成成分之一，其与肿瘤细胞之间的相互作用可以影响肿瘤的发生、发展及预后。一般认为，CAFs具有促进肿瘤生长、侵袭及转移的能力[2]。但由于其来源及构成的多样性，目前也有研究者认为其功能存在异质性，甚至具有抑制肿瘤的作用[4-6]。而针对iCAFs的研究也正从功能研究深入至iCCA靶点治疗等方面[7]。为进一步了解iCAFs影响肿瘤的作用机制，原代iCAFs的分离纯化和培养扩增是必要的。

目前，常见的CAFs的原代分离方法有组织块贴壁法和酶消化法。组织块贴壁法是将肿瘤组织剪碎成小块状，贴于培养瓶或培养皿壁上，加入适量培养基，待细胞从组织块边缘慢慢爬出。此方法简便易行，无需特殊的试剂和材料，便于推广。但也存在如下缺点[8]：(1)周期长，细胞从组织块边缘爬出一般需要10～15 d，同时刚爬出的细胞扩增能力差，3～4周左右才能长满瓶底；(2)纯度差，在细胞爬出过程中，会掺杂有其他种类细胞；(3)效率低，成功率仅约60%。

酶消化法是将肿瘤组织碾碎后，添加各种消化酶，经过振荡消化，将细胞从组织中分离出来形成单细胞悬液，再进行过滤、离心、接种的方法。此方法相较于组织块贴壁法具有周期短、重复性强、效率高等优势。目前使用较多的消化酶包括胰蛋白酶和胶原酶。胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的组织，对于iCCA这类组织内间质丰富的肿瘤，胰蛋白酶的消化效率则大大下降。本研究借鉴Mazzocca等[9]分离肝细胞肝癌相关成纤维细胞的经验，采用Ⅳ型胶原酶、透明质酸酶及BSA制备的消化液,对细胞恒温震荡消化，可以快速从肿瘤组织中分离出大量单细胞，且能更大程度保证细胞的活性。

在体外培养原代细胞时，通常需要实验的一致性和可重复性，这样才能保证这一细胞生物学特性研究结果的可靠性，因而细胞的纯化就成为原代细胞分离培养中关键的一步。无论是组织贴壁法还是酶消化法，所得的原代细胞中通常混杂有其他类型的细胞，因此在后续的培养传代中还需要通过自然纯化法、时间差酶消化法、机械刮除或反复贴壁等方法来进一步纯化[10]。这些方法大多需要经过多次传代，而代次的增加会影响原代细胞的生物学特性。本研究将酶消化法所得的单细胞悬液通过梯度离心去除大部分上皮细胞后，再进行免疫磁珠分选，用anti-fibroblast的磁珠抗体和LS柱阳性分选CAFs，所得细胞经流式细胞仪检测，显示其纯度达99.1%。免疫磁珠分选可以迅速纯化细胞，缩短整个原代细胞分离培养的时间，其缺点为：免疫磁珠抗体费用昂贵，且分选过程可能造成部分原代细胞的裂解或活力下降。

3.2iCAFs分离培养的关键问题原代iCAFs在分离培养过程中除需要注意无菌等原代细胞的分离培养的一般问题外，还要注意以下几个关键问题。(1)肿瘤组织的取材和运输：在肿瘤组织标本离体后应即刻取材，以免细胞的活性降低；切取的组织于冰上运输以保证组织新鲜。(2)组织块的剪切：所取的肿瘤组织尽量剪碎成肉糜状，以利于组织表面与消化液充分接触，缩短消化时间。(3)选择合适的消化酶：以往的报道显示乳腺癌、口腔癌等CAFs的原代分离通常用胰蛋白酶或Ⅰ型胶原酶[11-12]，但iCCA较这些肿瘤含有更多的间质成分。因此，本研究配置了含DMEM、0.1%BSA、1%双抗、500 U/mL Ⅳ型胶原酶、100 U/mL透明质酸酶的消化液。其中Ⅳ型胶原酶包含至少7种蛋白酶，可以消化多种组织；透明质酸酶可以降低细胞间质的黏性，利于单个细胞的析出；而BSA可以提高细胞消化过程中所需的营养。(4)恰当的消化时间：不同的肿瘤组织在不同的消化液浓度下所需要的消化时间也不同。本研究早期根据国外研究[8]的经验消化16 h，发现细胞均死亡，无法贴壁生长。而消化时间太短又无法获得足够量的单细胞。通过不断摸索，本研究确定于37℃恒温箱内以200 次/min持续震荡消化30～45 min基本可以获得满意的单细胞悬液。具体的消化时间根据需消化的组织量来决定。(5)免疫磁珠分选时注意动作轻柔，以避免细胞因发生机械性挤压而破裂、死亡。

综上所述，采用Ⅳ型胶原酶加透明质酸酶消化法联合免疫磁珠分选原代iCAFs，具有可重复性及高纯度获得的优势，为后续实验提供了良好的平台。

参考文献

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[本文编辑]姬静芳

Isolation, purification, and identification of intrahepatic cholangiocarcinoma associated fibroblasts

YANG Liu-xiao1, GAO Qiang2*

1.Department of Intensive Care Unit, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China 2.Department of Hepatic Surgery, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

[Abstract]Objective： To explore the methods of isolation, purification, and identification of intrahepatic cholangiocarcinoma (iCCA) associated fibroblasts (iCAFs), which could facilitate further functional and pharmacological evaluation.Methods： Under aseptic conditions the tissue specimens of iCCA were obtained, minced, and digested in the digestive medium supplemented with collagenase Ⅳ and hyaluronidase. The single-cell suspension underwent immunomagnetic separation and purification, and carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) were separated and cultured. Through morphological observation, immunofluorescent staining and flow cytometry analysis, whether the cells were iCAFs or not.Results： Morphologically, iCAFs were elongated or fusiform, with transparent cytoplasm, obvious refraction, single round or ovoid nucleus. Cellular processes overlap to form grids and show the "peak-valley" pattern. Under immunofluorescence, the typical iCAFs showed positive staining for alpha smooth muscle actin (α-SMA) and vimentin, and negative staining for pan-cytokeratin. Under flow cytometry detection, they were positive for α-SMA and negative for both CD34 and CD45.Conclusions： Enzyme digestion in combination with immunomagnetic separation can effectively separate iCAFs with high purity, providing a good platform for further studies on the roles of iCAFs in the pathogenesis of iCCA.

[Key Words]intrahepatic cholangiocarcinoma; carcinoma-associated fibroblasts; isolation; identification

[中图分类号]R 735.9

[文献标志码]A

[作者简介]杨柳晓，博士，主治医师. E-mail: yang.liuxiao@zs-hospital.sh.cn*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64041990, E-mail: gao.qiang@zs-hospital.sh.cn

[基金项目]国家自然科学基金(81372648, 81502028). Supported by National Natural Science Foundation of China(81372648, 81502028).

[收稿日期]2016-01-22[接受日期]2016-02-25