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千金藤素对骨肉瘤MG-63细胞迁移、侵袭能力影响的体外研究

2016-05-31许永涛佘远举

现代中西医结合杂志 2016年13期
关键词:侵袭迁移

马 亮,许永涛,佘远举

(湖北省荆州市中心医院,湖北 荆州 434020)



千金藤素对骨肉瘤MG-63细胞迁移、侵袭能力影响的体外研究

马亮,许永涛,佘远举

(湖北省荆州市中心医院,湖北 荆州 434020)

[摘要]目的探讨千金藤素对骨肉瘤MG-63细胞迁移和侵袭能力的影响及其相关机制。方法将培养的MG-63细胞分为10 μmol/L千金藤素组、40 μmol/L千金藤素组和对照组,观察3组划痕迁移试验、Transwell小室侵袭试验骨肉瘤MG-63细胞迁移、侵袭能力,用酶联免疫吸附试验检测3组基质金属蛋白酶-2(MMP-2)浓度。结果10 μmol/L千金藤素组、40 μmol/L千金藤素组细胞向划痕处迁移明显减少,且随着千金藤素浓度的增加,细胞向划痕处迁移明显减少。10 μmol/L千金藤素组、40 μmol/L千金藤素组穿膜细胞数明显少于对照组(P均<0.05),且40 μmol/L千金藤素组明显少于10 μmol/L千金藤素组。骨肉瘤MG-63细胞培养液中MMP-2浓度随着作用时间的延长而降低,10 μmol/L千金藤素组、40 μmol/L千金藤素组培养24 h、48 h、72 h的MMP-2浓度均明显低于对照组,且40 μmol/L千金藤素组均明显低于10 μmol/L千金藤素组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论千金藤素可抑制骨肉瘤MG-63细胞迁移和侵袭能力,这种抑制效应可能是通过抑制肿瘤细胞MMP-2的表达来实现的。

[关键词]千金藤素;骨肉瘤; 迁移;侵袭;细胞外基质

骨肉瘤是多发于青少年的一种增殖及侵袭性极强的恶性肿瘤,远处转移是患者死亡的重要原因,所以抑制骨肉瘤的侵袭及转移是其治疗的关键[1]。千金藤素作为一种升白细胞药物应用于临床已取得较好效果,其具有免疫调节、抗衰老、抗病毒、逆转肿瘤细胞多药耐药、抑制血管生成和调控细胞周期等作用[2-3],可以抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭[4]。但其对骨肉瘤细胞的影响报道少见。本研究探讨了千金藤素对骨肉瘤MG-63细胞迁移、侵袭力的影响,并对其作用机制进行初步探讨,现将结果报道如下。

1实验资料

1.1材料千金藤素购于昆明长春花科技有限公司。人骨肉瘤细胞株MG-63购自中国医学科学院上海细胞库。胎牛血清为杭州四季青公司产品;MEM/EBSS培养基为美国Hyclone公司产品。 基质胶、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶冻干粉(含EDTA)为美国Sigma公司产品;Transwell小室和培养板、培养瓶为美国Corning公司产品。

1.2方法

1.2.1细胞培养人骨肉瘤MG-63细胞培养于含10%胎牛血清及青-链霉素的MEM/EBSS培养液中,在37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养,生长至80%融合时, 0.25%胰蛋白酶消化细胞,弃去消化液,用少许培养基洗涤后再用培养基反复轻轻吹打后制备细胞悬液,以1∶4 的比例传代培养。

1.2.2划痕迁移实验将处于对数生长期的MG-63细胞接种于6孔细胞培养板上,接种密度为1×106mL-1,细胞培养箱中继续培养。将培养的MG-63细胞分为10 μmol/L千金藤素组、40 μmol/L千金藤素组和对照组,待24 h后细胞贴壁生长为单层细胞后,用200 μL枪头在培养板底部划一直线,用PBS漂洗2次,洗去划落的悬浮细胞,千金藤素2组分别加入含10 μmol/L及40 μmol/L千金藤素的培养液,对照组加入等量的常规培养液培养,继续培养24 h后倒置显微镜下观察细胞向划痕中迁移情况。

1.2.3Transwell侵袭实验实验分为10 μmol/L千金藤素组、40 μmol/L千金藤素组和对照组。基质胶使用前以无血清培养液稀释至50 mg/L,取50 μL加于小室的聚碳酸酯膜上,37 ℃孵育1 h使其成为凝胶状态。以含2%胎牛血清的培养液调整细胞浓度为1×106mL-1,在上室中,千金藤素2组分别加入以10,40 μmol/L千金藤素处理后的MG-63细胞悬液200 μL,对照组加入MG-63细胞悬液200 μL。下室加入400 μL完全培养液和NIH3T3成纤维细胞条件培养基作为趋化剂,常规培养24 h后取出小室,甲醇固定下室已经侵入的细胞5 min,0.1%结晶紫染色15 min后光镜下观察肿瘤细胞侵袭情况,并计数上、中、下及左、右5个视野中的透膜细胞数,每个标本重复3次。以侵袭细胞的数目来表示肿瘤细胞的相对侵袭力。

1.2.4基质金属蛋白酶-2(MMP-2)浓度检测实验分为10 μmol/L千金藤素组、40 μmol/L千金藤素组和对照组。每组用相应的培养液处理骨肉瘤MG-63细胞,在培养24 h、48 h及72 h时收集培养上清液,在酶联免疫检测仪上检测450 nm波长处的吸光度值,并用不同浓度标准品的浓度和OD值绘制标准曲线,根据实验样品OD值在标准曲线图上查出对应的MMP-2浓度。

1.3统计学方法采用SPSS 16.0软件进行统计学分析,采用单因素方差分析透膜细胞数及MMP-2表达水平差异,以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.13组骨肉瘤MG-63细胞迁移情况10 μmol/L千金藤素组、40 μmol/L千金藤素组与对照组比较,细胞向划痕处迁移明显减少,随着千金藤素浓度的增加,细胞向划痕处迁移明显减少。见图1~3。

2.23组骨肉瘤MG-63细胞侵袭情况对照组和10 μmol/L千金藤素组、40 μmol/L千金藤素组穿膜细胞数分别为(145.3±6.7)个、(94±8.9)个、(42±5.8)个,10 μmol/L千金藤素组、40 μmol/L千金藤素组穿膜细胞数明显少于对照组(P均<0.05),且40 μmol/L千金藤素组明显少于10μmol/L千金藤素组(P均<0.05)。见图4~6。

图1 对照组24 h骨肉瘤MG-63细胞向划痕处迁移情况(×40)

图2 10 μmol/L千金藤素组24 h骨肉瘤MG-63细胞

图3 40 μmol/L千金藤素组24 h骨肉瘤MG-63细胞

图4 对照组24 h后骨肉瘤MG-63细胞侵袭情况(×40)

2.33组不同处理时间骨肉瘤MG-63细胞培养液中MMP-2浓度骨肉瘤MG-63细胞培养液中MMP-2浓度随着作用时间的延长而降低,10μmol/L千金藤素组、40μmol/L千金藤素组培养24 h、48 h、72 h的MMP-2浓度均明显低于对照组,且40 μmol/L千金藤素组均明显低于10 μmol/L千金藤素组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

图5 10 μmol/L千金藤素组24 h后骨肉瘤MG-63细胞

图6 40 μmol/L千金藤素组24 h后骨肉瘤MG-63细胞

表1 3组不同处理时间骨肉瘤MG-63细胞培养液中

注:①与培养24 h比较,P<0.05;②与培养48 h比较,P<0.05;③与对照组比较,P<0.05;④与10 μmol/L千金藤素组比较,P<0.05。

3讨论

骨肉瘤肺转移多见,如何有效抑制骨肉瘤的侵袭及转移是治疗中的难题[5]。肿瘤的侵袭及远处转移涉及肿瘤细胞穿破细胞外基质屏障、侵入血管壁的基膜及迁徙到新部位等过程。大量研究证明,肿瘤细胞侵袭转移能力的强弱与肿瘤细胞诱导细胞外基质的降解及基底膜的破坏有关,而MMP在降解细胞外基质过程中起主要作用。MMP属于高度保守的依赖于锌离子的内切蛋白水解酶,根据其结构及作用底物的不同分为4类[6]。MMP-2是该家族中与肿瘤的浸润、侵袭、转移关系最为密切的一类蛋白酶,其作用的底物是Ⅳ 型胶原,这是基膜的主要成分。MMP-2能破坏基底膜的完整性,切断基底膜的支架即Ⅳ型胶原,破坏小血管、淋巴管的基底膜,从而引起血行和淋巴转移;还可降低肿瘤细胞与宿主细胞之间黏附性,使肿瘤细胞便于游走,穿破细胞外基质进入到血管中向远处转移;还可以促进肿瘤新生血管的形成,加速肿瘤的生长和转移[7]。MMP-2 能降解细胞外基质,使血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子等细胞因子的促血管新生活性增加,这些细胞因子也能间接或直接促进MMP-2的表达[8]。Wen等[9]分析发现MMP-2表达水平高的骨肉瘤患者预后要差。Korpi等[10]研究发现在取活检得样本中有86%的骨肉瘤患者MMP-2高表达,但在化疗后染色强度明显减弱,在化疗后切除的样本中只有50%的患者MMP-2高表达;在肺转移样本中,MMP-2抗体染色阳性,提示MMP-2在骨肉瘤的侵袭、转移中起重要作用,MMP-2高表达者预后不佳。

中药千金藤为防己科植物千金藤属的根或茎叶,其中活性成分众多。千金藤属植物主要含生物碱,按照其化学结构可分为6种类型[11]:吗啡二烯酮型、莲花烷型、阿朴碱型、原阿朴碱型、原小蘖碱型、双苄基异喹啉型。千金藤素是千金藤属药用植物中提取分离出来的有效成分,其属于双苄基异喹啉型[12]。千金藤素具有多种生物活性,可以通过多种机制参与肿瘤的预防和治疗,包括诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞浸润和转移、逆转肿瘤细胞多药耐药性等[13];还可以通过干扰质膜跨膜转运的功能,促进抗癌药物在肿瘤细胞内的积累,提高抗癌药物的疗效[14-15];其可以通过作用于巨噬细胞、T 细胞、NK 细胞等发挥免疫调节作用,从而产生抗肿瘤作用。Chen等[16]研究发现,千金藤素通过抑制STAT3 信号传导途径而发挥抗肿瘤作用。Harada等[17]报道千金藤素还可以通过作用于p27、p21等细胞周期调节因子,导致细胞周期阻滞发挥抗肿瘤作用。

本研究划痕迁移试验、Transwell小室侵袭试验发现,千金藤素能有效抑制MG-63细胞的迁移和侵袭能力,并且随着药物浓度的增加,抑制作用增强;千金藤素还能有效抑制MMP-2的表达,而且抑制程度呈剂量及时间依耐性。提示千金藤素是一个多靶点、多效应的抗肿瘤药物,其对骨肉瘤的侵袭及转移具有有效抑制作用,其作用机制可能与抑制MMP-2的表达有关,对于其他的作用机制及对各种相关基因表达水平的影响还需进一步研究。

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Effect of Cepharanthine on migration and invasion of osteosarcoma MG-63 cells in vitro

MA Liang, XU Yongtao, SHE Yuanju

(Jingzhou Central Hospital of Hubei Province, Jingzhou 434020, Hubei, China)

Abstract:Objective It is to study the effect of Cepharanthine on migration and invasion of osteosarcoma MG-63 cells in vitro, and explore the related mechanism. Methods The cultured MG-63 cells were divided into 10 μmol/L Cepharanthine group, 40 μmol/L cepharanthine group and control group.Wound healing assay and Transwell chamber method were used to detect the migration and invasion respectively. The level of the expression of matrix metal enzyme-2 was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results The migration of the cells in 10 μmol/L Cepharanthine group, 40 μmol/L cepharanthine group to the scratch area after 24 hours significantly reduced, with cepharanthine concentration increased, cell migration to scratches significantly reduced. The number of penetrating cells were less in cepharanthine groups than that in control group, and the numbers in 40 μmol/L cepharanthine group were less than that in 10 μmol/L Cepharanthine group. The level of MMP-2 expression of MG-63 cells decreased with the increase of Cepharanthine concentration and extension of treat time. The concentrations of MMP-2 in cell culture solution were lower in cepharanthine groups than that in control group, and the concentration in 40 μmol/L cepharanthine group were less than that in 10 μmol/L Cepharanthine group, the differences were all significant (P<0.05). Conclusion Cepharanthine could inhibit the migration and invasion of the osteosarcoma MG-63 cells in vitro.The inhibitory effect may be achieved by inhibiting the expression of MMP-2 in tumor cells.

Key words:Cepharanthine; osteosarcoma; migration; invasion; extracellular matrix

[收稿日期]2015-12-10

[中图分类号]R-33

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)13-1388-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.13.007

[作者简介]马亮,男,博士研究生,主治医师,研究方向为骨关节疾病的诊治。

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